[發明專利]一種兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物及其應用方法

在審

• 申請號: 202010542347.4
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111549146A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 張靖雯;楊江華;張效偉
• 申請（專利權）人: 南京易基諾環保科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務所 32346
• 代理人: 王琳琳;陳彬

1.一種兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物，其特征在于：包括至少一條上游引物和一條下游引物組合的引物對，

所述的上游引物序列包括：

Am312-F1：TAGAGGAGCCTGTNCTATAATCGAT；

Am246-F2：CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；

Am250-F3：ACGAGAAGACCCNATGGAGCTT；

所述的下游引物序列包括：

Am312-R1：GAAGAGGGNGACGGGCGGTGTGT；

Am246-R2：AAGCTCCATNGGGTCTTCTCGT；

Am250-R3.1：CGCTGTTATCCCNAGGGTAACTTG；

Am305-R3.2：ATCCAACATCGAGGTCGTAAACC；

Am387-R3.3：CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG。

2.根據權利要求1所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物對組合包括以下幾種方式：(1)Am312-F1與Am312-R1組合；(2)Am246-F2與Am246-R2組合，(3)Am250-F3與Am250-R3.1組合，(4)Am250-F3與Am250-R3.2組合，(5)Am250-F3與Am250-R3.3組合。

3.權利要求1～2任意一項所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)DNA樣本的提取；

(2)目的片段的擴增：對步驟(1)中的DNA樣本進行PCR擴增，其中，PCR擴增引物采用至少一條所述上游引物和至少一條所述下游引物組合成的引物對；

(3)針對步驟(2)中擴增產物的片段大小分析，或對步驟(2)中的擴增產物進行高通量測序。

4.根據權利要求3所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述上游引物與所述下游引物組合的摩爾比為1：(1～3)。

5.根據權利要求4所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述引物對進行PCR反應的退火溫度約為55℃左右。

6.根據權利要求5所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述DNA樣本包括環境源DNA樣本及生物源DNA樣本。

7.根據權利要求6所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述步驟(2)中待擴增的DNA樣本濃度為0.1ng/μL以上。

8.根據權利要求5或6所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述步驟(2)中，擴增反應體系的體積為30μL，反應體系中包含以下物質：2μL的10μM的上述引物，所述的上游引物和下游引物體積各1μL；12μL的去離子水；15μL的Taq MasterMix；1μL的DNA樣本。

9.根據權利要求4所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物的應用方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述上游引物與所述下游引物組合的摩爾比為1：1。

10.權利要求1～2任意一項所述的兩棲動物線粒體通用宏條形碼擴增引物在兩棲動物物種鑒定、兩棲動物多樣性、系統發育關系、系統地理學或遺傳多樣性分析中的應用。