[發明專利]一種雙孢蘑菇血紅素雙加氧酶制備方法及其應用有效
| 申請號： | 202010541603.8 | 申請日： | 2020-06-15 |
| 公開（公告）號： | CN111690644B | 公開（公告）日： | 2023-08-22 |
| 發明（設計）人： | 邱立友;劉皓皓;高玉千;李亞楠;戚元成;張朝輝 | 申請（專利權）人： | 河南農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12P7/04 |
| 代理公司： | 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104 | 代理人： | 張曉萍 |
| 地址： | 450002 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 蘑菇 血紅素 雙加氧酶 制備 方法 及其 應用 | ||
1.一種1-辛烯-3-醇的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：
（一）制備雙孢蘑菇血紅素雙加氧酶反應液
（1）提取總RNA并反轉錄為cDNA備用
以雙孢蘑菇菌絲為樣品，提取總RNA，并反轉錄為cDNA備用；
（2）PCR擴增
設計PCR擴增用引物序列如下：
AbD-F：5’-TGGTGGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTCCAAGAGGCTCTCTGGTATC-3’，
AbD-R：5’-TTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGAAGCATCATACTGAATGG-3’；
以步驟（1）中所合成制備cDNA為模板，進行PCR擴增；
（3）制備重組表達載體pCold-TF-AbD
以質粒pCold-TF為原核表達載體，將步驟（2）的PCR擴增產物與質粒pCold-TF分別進行
（4）轉化并誘導表達
采用化學轉化法，將步驟（3）的重組表達載體pCold-TF-AbD轉化大腸桿菌BL21，隨后，將轉化正確的重組菌株在LB培養基中，培養擴增并加入IPTG誘導劑以進行誘導表達；
（5）制備反應液
誘導表達結束后，取菌液，離心并將菌體重懸于PBS?buffer中，細胞破碎，獲得細胞上清液作為反應液；
（二）制備1-辛烯-3-醇
將步驟（一）中所制備反應液與亞油酸按體積比1:1混合均勻后，密封、25℃靜置反應2h。
2.雙孢蘑菇血紅素雙加氧酶在1-辛烯-3-醇制備中的應用，其特征在于，基于基因工程技術在大腸桿菌中進行異源表達制備雙孢蘑菇血紅素雙加氧酶時，IPTG誘導表達結束后，以細胞破碎后上清液作為反應液；
所述雙孢蘑菇血紅素雙加氧酶的編碼基因序列如SEQ?ID?No.?1所示。
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