[發(fā)明專利]三種嘎啦蘋果特異性分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010539547.4
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111560463B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尼秀媚;鐘飛;王曉菲;王彥娟;王超;呂金浮;劉曉明;劉永光
• 申請（專利權(quán)）人: 山東豐沃植物研究院有限公司;濰坊科技學(xué)院;青島歐易生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6809;C12N15/11;G16B30/00
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本發(fā)明公開了三種嘎啦蘋果特異性分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用，包括下列步驟：（1）取葉片提取基因組DNA；（2）按照簡化基因組測序技術(shù)Super?GBS方法構(gòu)建文庫，文庫質(zhì)檢合格后上機測序；（3）對測序數(shù)據(jù)進行過濾后，使用GATK獲得SNP位點，并對SNP進行過濾，以提高SNP的準(zhǔn)確性；（4）根據(jù)每個品種的分型結(jié)果篩選不同品種間至少有一個品種與其他品種不同的位點；（5）根據(jù)上述篩選策略，最終篩選到11個鑒定3種嘎啦蘋果的SNP位點。基于這些標(biāo)記開發(fā)出一種簡便、快速、可靠鑒定三種嘎啦蘋果的方法，為從源頭準(zhǔn)確控制品種奠定技術(shù)基礎(chǔ)；三種嘎啦蘋果的組培苗、嫁接苗能夠準(zhǔn)確的區(qū)分，確保育種企業(yè)對品種的把控，減少由于品種誤差造成的經(jīng)濟損失。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及三種嘎啦蘋果特異性分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蘋果(Malus pumila Mill.)是世界上重要的落葉果樹之一，深受消費者喜歡，近年來發(fā)展十分迅速。我國已成為世界上最大的蘋果生產(chǎn)國和出口國，我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量分別為246.69萬hm2和4388.23萬t，均居世界首位(叢佩華等,2018)。全世界有將近上萬個登記的蘋果品種，目前我國主栽的蘋果主要有8個系列，60余個品種，其中最重要的6個系列分別是富士系(63.5％)、元帥系(7.6％)、秦冠(14.6％)、嘎拉(1.9％)、華冠(3.7％)、金冠(1.4％)、栽植面積之和占全國栽植總量的92.4％。在過去的幾十年中，通常根據(jù)形態(tài)、生理和一些農(nóng)藝性狀對果樹品種(系)進行鑒定。然而，傳統(tǒng)的基于形態(tài)性狀的品種鑒定需要廣泛的觀察成熟的植物。而且，在許多情況下，它缺乏準(zhǔn)確的定義和客觀性(Wrigley etal.,1987)。此外，受環(huán)境影響，形態(tài)學(xué)性狀不能作為明確的標(biāo)記。嘎啦系列蘋果中嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦是目前嘎啦系列品種的主栽品種，但這三種蘋果在苗期相似度非常高，而我國目前蘋果品種正處在新舊品種更替，矮化密植已經(jīng)是發(fā)展的趨勢，因此提供簡便可靠的方法確保種苗企業(yè)能夠從源頭上對品種控制準(zhǔn)確顯得尤為重要。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)也稱為DNA指紋圖譜技術(shù)，能以個體間遺傳物質(zhì)的核苷酸序列變異為基礎(chǔ)，直接反應(yīng)不同品種/亞群間基因組水平上的遺傳多態(tài)性，具有可遺傳性和可識別性。在過去的20年間，分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展成功的解決了這一難題。另一方面，不像限于多態(tài)性和時空變化的生化標(biāo)記，品種特異的遺傳標(biāo)記因不受生理或環(huán)境的影響而在品種鑒定工作中呈現(xiàn)獨特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中三種嘎啦蘋果苗期不易鑒定的缺陷，本發(fā)明提供一種嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦蘋果的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，并應(yīng)用該方法鑒定到11個品種特異的SNP標(biāo)記，基于這些標(biāo)記開發(fā)出一種簡便、快速、可靠鑒定三種嘎啦蘋果的方法，為從源頭準(zhǔn)確控制品種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

首先，本發(fā)明提供一種利用簡化基因組測序技術(shù)Super-GBS篩選嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦蘋果的特異性分子標(biāo)記的方法，包括如下步驟：

(1)利用品種已知的12個嘎啦、9個nema嘎啦和5個新嘎啦蘋果為樣品，取葉片提取基因組DNA；

(2)按照簡化基因組測序技術(shù)Super-GBS方法構(gòu)建文庫，文庫質(zhì)檢合格后上機測序；

(3)對測序數(shù)據(jù)進行過濾后，使用GATK獲得SNP位點；

(4)對SNP進行過濾，過濾條件為：SNP測序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位點；剔除SNP分型缺失率高于20％的位點；剔除所有樣品中分型一致的位點。

(5)根據(jù)每個品種的分型結(jié)果，篩選每個品種內(nèi)所有個體分型完全一致、分型一致位點沒有個體缺失，且與其他品種不同的位點；最終篩選到11個SNP位點，具體見下表1。

表1能夠準(zhǔn)確區(qū)分三種嘎啦蘋果的位點信息