[發明專利]一種遺傳編碼的甲醛反應性非天然氨基酸、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202010538098.1
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111747869B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 彭濤;張雨晴;杜一萌
• 申請（專利權）人: 北京大學深圳研究生院
• 主分類號: C07C271/22
• 分類號: C07C271/22;C07C269/06;C07C269/04;C07C271/16;C07C213/02;C07C217/46;C09K11/06;C07K14/435;C12N9/02;C12N9/00;C12N15/52;C12P21/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 樊穎

本發明涉及一種遺傳編碼的甲醛反應性非天然氨基酸。具體而言，本發明公開了一種遺傳編碼的甲醛反應性非天然氨基酸PrAK、制備方法及其應用于甲醛的檢測和成像。本發明提供的甲醛反應性非天然氨基酸PrAK可以在蛋白質翻譯過程中位點特異地引入綠色熒光蛋白(EGFP)和螢火蟲熒光素酶(fLuc)等生物大分子中，構建反應型生物大分子甲醛熒光探針和生物發光探針，能有效檢測或成像生物樣本中的甲醛。

技術領域

本發明涉及生物樣品檢測領域，具體涉及生物樣品中甲醛的檢測領域。

技術背景

甲醛是一種最簡單的活性羰基化合物(Reactive carbonyl species，RCS)，是眾所周知的廣泛用于工業和生物醫學的基本化學原料，也是一種常見的環境危害物和致癌物。但少為人知的是，在生物系統的一系列生物過程中，包括表觀遺傳調控、一碳單位代謝能和酒精解毒等，都能產生甲醛。例如，賴氨酸脫甲基化酶(lysine-specificdemethylase，LSD)或組蛋白脫甲基化酶(JmjC domain-containinghistonedemethylases，JHDM)能通過催化組蛋白的去甲基化產生甲醛副產物；在一碳單位代謝中，對氨基脲敏感的胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase，SSAO)通過催化甲胺的去氨基化而生成甲醛；此外，在細胞內甲醇可以被醇脫氫酶1(alcohol dehydrogenase1，ADH1)氧化生成甲醛。除了多種內源性甲醛來源外，生物體內也存在相應的分子機制來分解甲醛，例如通過醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)或醇脫氫酶3(alcoholdehydrogenase 3，ADH3，又名ADH5)的作用將其氧化成甲酸。因此，在生理條件下，生物體內甲醛的濃度會維持在一個穩定的水平，如在血液或尿液中甲醛的濃度大概是0.1mM。而在大腦和細胞內大約是0.2-0.4mM。生理水平的內源性甲醛是重要的一碳來源，可用于制造重要的細胞結構單元并作為信號分子介導正常的生理過程。但是，已有報道表明機體內源性甲醛濃度的異常增高與一系列疾病的發生過程相關，包括癌癥、阿爾茨海默癥、中風和糖尿病。事實上，中度和重度癡呆患者的尿液中甲醛濃度水平是健康對照組的三倍多，達到0.3-0.4mM；而據估計，癌癥組織中甲醛濃度可高達0.8mM。然而目前對甲醛在生理和病理過程中的確切作用仍知之甚少，這促使人們不斷努力開發新的檢測生物樣品中甲醛的工具。

雖然傳統的檢測方法包括比色分析、色譜法和放射檢驗法都可以用來測量血漿和勻漿組織中的甲醛水平，然而這些方法都需要復雜的樣品處理過程，會破壞樣本的完整性，限制了在活體生物樣品中無創和原位檢測甲醛的應用。光學探針，尤其是熒光探針和生物發光探針，具有非侵入性、實時性和時空成像能力等優點，已經成為甲醛檢測的有力替代選擇。因此，開發甲醛光學探針(包括甲醛熒光探針和生物發光探針)對于檢測和成像生物樣品中甲醛的含量，并揭示甲醛在生理和病理條件下的作用至關重要。在過去的幾年里，一系列針對甲醛的小分子熒光探針和生物發光探針已經被開發出來。然而，基于蛋白質的遺傳編碼甲醛熒光探針和生物發光探針目前還鮮有報道。相比于小分子光學探針，基于蛋白質的遺傳編碼甲醛熒光探針和生物發光探針能以DNA的形式引入活細胞或生物體內，具有獨特的優勢，如優越的細胞滯留性，細胞特異和亞細胞器特異靶向性，以及穩定持久的標記等。有鑒于此，本發明公開了一種遺傳編碼的甲醛反應性非天然氨基酸PrAK，將其位點特異地引入蛋白質，如增強綠色熒光蛋白(EGFP)和螢火蟲熒光素酶(fLuc)中，分別用于構建基于蛋白質的遺傳編碼甲醛熒光探針和生物發光探針，選擇性檢測和成像生物樣品中的甲醛。