[發(fā)明專利]一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法及運(yùn)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010537252.3
• 申請(qǐng)日: 2020-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111647644B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢菲沙基因信息有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢天領(lǐng)眾智專利代理事務(wù)所(普通合伙) 42300
• 代理人: 陳三九

1.一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)；以及S2，新冠病毒建庫(kù)；

其中，步驟S1為：獲取新冠病毒基因組一致性序列，設(shè)計(jì)病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；所述引物位置基于基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)，所述引物在新冠病毒基因組上共有106個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所述引物結(jié)合位點(diǎn)最小距離為3bp，最大距離為757bp；

所述一致性序列如SEQ?ID?NO:1?所示，所述引物為15條，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2-SEQ?ID?NO:16?所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述步驟S2為：將所述步驟S1中15個(gè)引物等體積混合后，與環(huán)境樣本RNA進(jìn)行?DNA-RNA雜合鏈合成，再利用Tn5?VR轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述步驟S2中，所述環(huán)境樣本RNA樣本濃度為0.01~0.15ng/uL，總量為0.1~1.5ng。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述步驟S2中，所述?DNA-RNA雜合鏈合成步驟為：

取環(huán)境RNA、混合引物、dNTP混合液混合后離心，孵育后冷卻；

所得反應(yīng)液與5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、RNA酶抑制劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合后離心，孵育后冷卻。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述步驟S2中，所述建庫(kù)步驟為：

取所述DNA-RNA雜合鏈合成所得反應(yīng)液，與Tagment緩沖液、Tn5?VR轉(zhuǎn)座酶混合后，離心、孵育后冷卻后，加入終止液再進(jìn)行孵育；

與擴(kuò)增預(yù)混液、PCR引物混合物混合后離心、經(jīng)孵育冷卻；

加入N5端引物和N7端引物混合后離心，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)純化、洗脫后獲得測(cè)序文庫(kù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增預(yù)混液為VAHTS?HiFi?Amplification?Mix，所述PCR引物混合物為PCR?PrimerMix?3?for?Illumina。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)為98℃保持3min；98℃保持20s、60℃保持15s、72℃保持30s，共18個(gè)循環(huán)；72℃保持5min。

8.權(quán)利要求1-7所述任意一項(xiàng)新冠病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的建庫(kù)方法在新冠病毒測(cè)序中的運(yùn)用，所述運(yùn)用為非診斷。