[發明專利]一株異源表達纖維素酶基因EGⅣ的畢赤酵母工程菌株及應用

在審

• 申請號: 202010535506.8
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111893107A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 鐘成;王新光;沈鈺清;賈士儒;李文超
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 鄭海松

1.一種畢赤酵母中異源表達內切葡聚糖酶EGⅣ蛋白的構建方法，包括以下步驟：

(1)里氏木霉RNA和cDNA的獲得：培養里氏木霉QM9414，直至出綠色孢子，然后接種于固體誘導培養基(表面貼有玻璃紙)獲得菌絲體，用試劑盒提取總RNA和反轉錄得到cDNA；

(2)目的基因的克隆：設計合理引物，合適的條件，PCR擴增出EGⅣ的基因；

(3)構建表達載體：以Ppic9k質粒為載體，將EGⅣ基因插入啟動子AOX1下游，5'端酶切位點為EcoR Ⅰ，3'端酶切位點為Not Ⅰ，構建Ppic9k-EGⅣ表達載體；

(4)獲取重組菌株：以bgl Ⅰ為Ppic9k-EGⅣ表達載體的線性化位點。實現表達載體線性化，然后通過電轉化轉入畢赤酵母，得到EGⅣ的重組酵母；

(5)重組菌株的篩選：利用含不同濃度的抗生素G418的YPD平板篩選含有高拷貝整合質粒的重組酵母菌株；

(6)誘導表達條件的優化：將菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5％甲醇)中誘導，29℃，280rpm，振蕩培養。24h、48h、72h、96h、120、144、168取樣，每次取樣都會補充一定量的甲醇，通過測定酶活和蛋白含量以確定最佳的誘導時間；將重組菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中進行不同溫度(24、26、28、30℃)誘導，280rpm，振蕩培養，在最佳誘導時間取樣，每24h補充一定量的甲醇，確定最佳誘導溫度；將重組菌株接至含0.5％甲醇的發酵培養基BMMY中進行不同轉速誘導，在最佳溫度培養，最佳誘導時間取樣，每24h補充一定量的甲醇，確定最佳誘導轉速；

(7)重組菌株的誘導產酶：將篩選后的菌株，搖瓶發酵，加入適當甲醇誘導產酶；

(8)重組蛋白活性檢測：剛果紅-CMC方法檢測重組畢赤酵母是否分泌有活性的纖維素降解酶；

SDS-PAGE檢測重組蛋白是否為目的蛋白及其蛋白表達量；

(9)酶學性質分析：通過硫酸銨沉淀、鎳柱純化得到電泳純水平的重組酶，在不同pH條件下測酶活，確定最適pH；在最適pH，不同溫度條件下測定重組酶酶活，確定最適溫度；在重組酶的最適pH和最適溫度下，取不同濃度的底物CMC，測得相應的反應速度V，得到重組酶的動力學常數；

(10)菌株的保藏：表達纖維素酶基因EGⅣ的畢赤酵母工程菌株的保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期：2019年8月26日；酵母工程菌株編號：CGMCCNo.18421；畢赤酵母工程菌株的分類命名為：巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。

2.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅣ蛋白的構建方法，其特征在于，誘導重組菌株表達產酶時，研究了其誘導表達條件：發酵液中目的蛋白EGⅣ酶活在120h，28℃，260rpm時達到最大酶活值，EGⅣ酶活力可達4.87IU/mL，得到較大產量的目的蛋白，便于后續目的蛋白的純化。

3.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅣ蛋白的構建方法，其特征在于，優化了目的基因的引物序列,合理引入6個組氨酸(His)對應的密碼子，以使得表達的目的蛋白中含組氨酸，通過鎳柱對目的蛋白進行分離純化，便于后續對重組蛋白酶酶學性質分析。

4.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅣ蛋白的構建方法，其特征在于，酶學性質測得EGⅣ的最適pH為5.0、最適溫度為60℃、Km值約為2.4mg/mL，Vmax值約為156.6IU/mg，得到重組酶的基本酶學性質與天然里氏木霉分泌酶的酶學性質相似，可代替里氏木霉天然分泌核心酶組分用于纖維素基質水解中。

5.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅣ蛋白的構建方法，其特征在于，實現了纖維素酶蛋白EGⅣ在畢赤酵母中的異源表達,加入適量甲醇誘導產酶，提高了產酶效率，提升重組畢赤酵母菌的工業生產潛力。