[發明專利]異源表達纖維素酶基因EG Ⅱ的畢赤酵母工程菌株及應用

在審

• 申請號: 202010535478.X
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111893131A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 李文超;沈鈺清;王新光;賈士儒;鐘成
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/62;C12N9/42;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 鄭海松

1.構建一種異源表達纖維素酶基因EGⅡ的畢赤酵母工程菌株的方法包括如下步驟：

(1)里氏木霉RNA和CDNA的獲得：將-80℃的里氏木霉QM9414甘油管解凍后接種到PDA培養基平板。封口，30℃培養箱正置培養至長出綠色的孢子，接種于誘導培養基獲得菌絲體，用試劑盒提取總RNA和反轉錄得到cDNA；

(2)目的基因的克?。涸O計合理引物將6個組氨酸(His)密碼子導入到目的基因片段中，利用PCR技術擴增出目的基因；

(3)構建表達載體：采用同源重組的方法，以Ppic9k質粒為載體，將EGⅡ基因插入啟動子AOX1下游，5’端酶切位點為EcoRⅠ，3’端酶切位點為NotⅠ,構建Ppic9k-EGⅡ表達載體；

(4)獲取重組菌株：(以里氏木霉cDNA為模板，通過PCR成功擴增出目的片段，經雙酶切法成功構建了重組質粒pPIC9K-EGⅡ)；以bglⅡ為Ppic9k-EGⅡ表達載體的線性化位點，實現表達載體線性化，然后通過電轉化轉入宿主畢赤酵母中，通過MD平板、MM平板，YPD平板(含不同濃度濃度G418)，基因組PCR成功獲得重組菌株P.pastoris-eg2-3；

(5)重組菌株的篩選：利用含不同濃度的抗生素G418的YPD平板篩選含有高拷貝整合質粒的重組酵母菌株；

(6)誘導表達條件的優化：將菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5％甲醇)中誘導，29℃，280rpm，振蕩培養。24h、48h、72h、96h、120、144、168取樣，每次取樣都會補充一定量的甲醇，通過測定酶活和蛋白含量以確定最佳的誘導時間；將重組菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中進行不同溫度(24、26、28、30)℃誘導，280rpm，振蕩培養，在最佳誘導時間取樣，每24h補充一定量的甲醇，確定最佳誘導溫度；將重組菌株接至含0.5％甲醇的發酵培養基BMMY中進行不同轉速誘導，在最佳溫度培養，最佳誘導時間取樣，每24h補充一定量的甲醇，確定最佳誘導轉速；

(7)重組菌株的誘導產酶：使篩選后的菌株在已優化的誘導表達條件中產酶；

(8)重組蛋白活性檢測：利用剛果紅-CMC方法檢測重組畢赤酵母是否分泌出具有活性的纖維素降解酶；利用SDS-PAGE檢測重組蛋白是否為目的蛋白及其蛋白表達量；

(9)酶學性質分析：通過硫酸銨沉淀、鎳柱純化得到電泳純水平的重組酶，在不同pH條件下測酶活，確定最適pH；在最適pH，不同溫度條件下測定重組酶酶活，確定最適溫度；在重組酶的最適pH和最適溫度下，取不同濃度的底物CMC，測得相應的反應速度V，得到重組酶的動力學常數。

2.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅡ基因的構建方法和權利要求2所述的目的蛋白EGⅡ最佳誘導表達條件，其特征在于，優化了目的基因的引物序列，合理引入6個組氨酸(His)對應的密碼子，以使得表達的目的蛋白中含組氨酸，通過鎳柱對目的蛋白進行分離純化，便于后續利用鎳柱對重組蛋白酶酶學性質進行分析。

3.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅡ基因的構建方法，其特征在于，菌株P.pastoris-eg2-3經甲醇誘導168h，28℃，260rpm后，EGⅡ酶活力可達18.5IU/mL得到較大產量的目的蛋白，便于后續目的蛋白的純化。

4.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅡ基因的構建方法，其特征在于，酶學性質測得EGⅡ的最適pH為4.5、最適溫度為60℃、Km值約3.6mg/mL，V_max值約241.8IU/mg得到重組酶的基本酶學性質與天然里氏木霉分泌酶的酶學性質相似，可代替里氏木霉天然分泌核心酶組分用于纖維素基質水解中。

5.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅡ基因的構建方法，其特征在于，實現了纖維素酶蛋白EGⅡ在畢赤酵母中的異源表達,提高了重組畢赤酵母菌在甲醇誘導發酵過程中的產酶效率,提升重組畢赤酵母菌的工業生產潛力。

6.根據權利要求1所述的一種畢赤酵母中異源表達EGⅡ基因的構建方法，其特征在于，所述工程菌種為Pichia pastoris-eg2，該菌的分類命名為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，于2019年8月26日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.18420。