[發明專利]異源表達纖維素酶基因CBH Ⅱ的畢赤酵母工程菌株及應用

在審

• 申請號: 202010534742.8
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111850027A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 鐘成;沈鈺清;王新光;賈士儒;李文超
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/62;C12N9/42;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 鄭海松

本發明公開了兩株異源表達纖維素酶基因CBHⅡ的畢赤酵母工程菌及其應用，所述的工程菌為Pichia pastoris?cbh2，其于2019年8月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No.18419。通過PCR方法從里氏木霉獲得葡萄糖外切酶Ⅱ(CBHⅡ)，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，獲得pPIC9K?cbh2表達載體。并通過電轉化將載體導入到畢赤酵母GS115中獲得重組畢赤酵母菌株，用不同濃度的抗生素G418篩選含有高拷貝整合質粒的重組酵母菌株，并通過搖瓶發酵初步優化確定了最佳誘導條件，同時對純化后的重組蛋白酶酶學性質分析。

技術領域

本發明涉及異源表達纖維素酶基因CBH Ⅱ的畢赤酵母菌株的構建及應用，屬于纖維素酶基因工程技術領域。

背景技術

木質纖維素是一種豐富的可再生資源，其可以轉化為多種生物能源和化學產品。將木質纖維素轉化為燃料乙醇的研究正受到越來越多的關注。但是木質纖維素轉化生產燃料乙醇過程中，酶制劑成本及酶解過程約占其生產成本的40％，所以降低纖維素酶生產成本或通過統合生物加工過程(Consolidated bioprocessing， CBP)整合酶解和發酵過程是提高木質纖維素乙醇生產經濟性的重要手段。

纖維素酶是由多種酶系組成的復合酶系統，包括外切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市場上大多數商業纖維素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉與黑曲霉等。其中里氏木霉抗代謝抑制能力強，生產的纖維素酶具有較高的酶活性，已成為工業上應用最廣泛的纖維素酶生產菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多種蛋白質，導致纖維素酶所占的比例不高，并且各纖維素酶的比例主要由其自身調控，很難進行人工控制。通過在酵母中表達外源基因生產纖維素酶不僅能夠使酵母具備直接降解纖維素的能力，而且可以通過人工手段來調控酶的合成與分泌，有利于對纖維素酶的酶學性質和相互作用進行研究，從而進一步提高其酶活能力。

目前，重組蛋白表達系統主要有：大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、轉基因植物或動物表達系統和體外翻譯系統。其中，真核生物具有生長快、培養容易、遺傳操作簡單，同時還可以對表達蛋白進行加工、修飾和折疊等特點，因此真核生物的表達系統越來越受到重視和廣泛應用。其中巴斯德畢赤酵母表達系統是最近發展起來的較為完善的、應用最廣泛的甲醇營養型酵母表達系統。重組畢赤酵母菌株外源基因表達能力強，穩定性高，可以胞外分泌纖維素酶蛋白，并且自身分泌的蛋白成分極少有利于表達蛋白的分離純化。

發明內容

本發明提供了一種重組表達CBH Ⅱ的畢赤酵母工程菌Pichia pastoris-CBH2。該菌的分類命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，于2019年 8月26日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.18419。本發明的目的是利用基因工程的技術手段，將里氏木霉的纖維素外切葡聚糖酶CBH Ⅱ基因轉化入畢赤酵母中，構建畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達纖維素外切葡聚糖酶CBH Ⅱ，為了提高重組菌株的產酶量，研究了搖瓶培養的誘導時間、溫度、轉速。并且對分離純化后的蛋白酶進行了酶學性質分析。

本發明提供的異源表達纖維素酶基因CBH Ⅱ的畢赤酵母菌株系統具體步驟如：

(1)里氏木霉RNA和cDNA的獲得：將-80℃的里氏木霉QM9414甘油管解凍后接種到PDA培養基平板。封口，置于30℃培養箱培養至長出綠色的孢子，接種于誘導培養基獲得菌絲體，用試劑盒提取總RNA、反轉錄得到cDNA；

(2)目的基因的克隆：設計合理引物，將6個組氨酸(His)密碼子導入到目的基因片段中，利用PCR技術擴增出目的基因；

(3)構建表達載體：采用同源重組的方法，以Ppic9k質粒為載體，將CBH Ⅱ基因插入啟動子AOX 1下游，5’端酶切位點為EcoRⅠ，3’端酶切位點為Not Ⅰ，構建Ppic9k-CBH Ⅱ表達載體。