[發(fā)明專利]一株異源表達纖維素酶基因EGⅤ的畢赤酵母工程菌株及應用

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• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111893106A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設計）人: 李文超;王新光;沈鈺清;賈士儒;鐘成
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 鄭海松

本發(fā)明公開了一種異源表達纖維素酶基因EGⅤ的畢赤酵母工程菌及其應用，所述的工程菌為Pichia pastoris?eg5，其于2019年8月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.18422。通過PCR方法從里氏木霉獲得葡萄糖內(nèi)切酶基因(EGⅤ)，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，獲得pPIC9K?eg5表達載體。通過電轉(zhuǎn)化將載體導入到畢赤酵母GS115中獲得重組畢赤酵母菌株，用不同濃度的抗生素G418篩選含有高拷貝整合質(zhì)粒的重組酵母菌株。并通過搖瓶發(fā)酵初步優(yōu)化確定了最佳誘導條件，同時對純化后的重組蛋白酶酶學性質(zhì)分析。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于纖維素酶基因工程技術(shù)領域,尤其涉及異源表達纖維素酶基因EGⅤ的畢赤酵母菌株的構(gòu)建及應用。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是一種豐富的可再生資源，其可以轉(zhuǎn)化為多種生物能源和化學產(chǎn)品。將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的研究正受到越來越多的關注。但是木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇過程中，酶制劑成本及酶解過程約占其生產(chǎn)成本的40％，所以降低纖維素酶生產(chǎn)成本或通過統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocessing，CBP)整合酶解和發(fā)酵過程是提高木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟性的重要手段。

纖維素酶是由多種酶系組成的復合酶系統(tǒng)，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市場上大多數(shù)商業(yè)纖維素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉與黑曲霉等。其中里氏木霉抗代謝抑制能力強，生產(chǎn)的纖維素酶具有較高的酶活性，已成為工業(yè)上應用最廣泛的纖維素酶生產(chǎn)菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多種蛋白質(zhì)，導致纖維素酶所占的比例不高，并且各纖維素酶的比例主要由其自身調(diào)控，很難進行人工控制。通過在酵母中表達外源基因生產(chǎn)纖維素酶不僅能夠使酵母具備直接降解纖維素的能力，而且可以通過人工手段來調(diào)控酶的合成與分泌，有利于對纖維素酶的酶學性質(zhì)和相互作用進行研究，從而進一步提高其酶活能力。

目前，重組蛋白表達系統(tǒng)主要有：大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、轉(zhuǎn)基因植物或動物表達系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng)。其中，真核生物具有生長快、培養(yǎng)容易、遺傳操作簡單，同時還可以對表達蛋白進行加工、修飾和折疊等特點，因此真核生物的表達系統(tǒng)越來越受到重視和廣泛應用。其中巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是最近發(fā)展起來的較為完善的、應用最廣泛的甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)。重組畢赤酵母菌株外源基因表達能力強，穩(wěn)定性高，可以胞外分泌纖維素酶蛋白，并且自身分泌的蛋白成分極少有利于表達蛋白的分離純化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組表達EGⅤ酶的畢赤酵母工程菌，即利用基因工程的技術(shù)手段，將里氏木霉的纖維素內(nèi)切葡聚糖酶EGⅤ基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，構(gòu)建畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達纖維素內(nèi)切葡聚糖酶EGⅤ，為了提高重組菌株的產(chǎn)酶量，研究了搖瓶培養(yǎng)的誘導時間、溫度、轉(zhuǎn)速。并且對分離純化后的蛋白酶進行了酶學性質(zhì)分析。最終將菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

(1)里氏木霉RNA和CDNA的獲得：將里氏木霉QM9414培養(yǎng)出綠色孢子，接種于誘導培養(yǎng)基獲得菌絲體，用試劑盒提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

(2)目的基因的克隆：設計合理引物，PCR擴增出目的基因；

(3)構(gòu)建表達載體：以Ppic9k質(zhì)粒為載體，將EGⅤ基因插入啟動子AOX1下游，5'端酶切位點為EcoRⅠ，3'端酶切位點為NotⅠ，構(gòu)建Ppic9k-EGⅤ表達載體；

(4)獲得重組菌株：以里氏木霉cDNA為模板，通過PCR成功擴增出目的片段，經(jīng)雙酶切法成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-EGⅤ；通過電轉(zhuǎn)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母，通過MD平板、MM平板、YPD平板(含不同濃度濃度的G418)、基因組PCR獲得重組菌株；

(5)重組菌株的篩選：利用含不同濃度的抗生素G418的YPD平板篩選含有高拷貝整合質(zhì)粒的重組酵母菌株；