[發明專利]快速檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 202010534105.0
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111500765B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 任維超;李保華
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 青島鼎丞智佳知識產權代理事務所(普通合伙) 37277
• 代理人: 韓耀朋

本發明公開了快速檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法，所述LAMP引物由一對外引物F3和B3、一對內引物FIP和BIP以及一對環引物LF和LB組成。其中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQ ID No.2所示，內引物FIP如SEQ ID No.3所示，內引物BIP如SEQ ID No.4所示，環引物LF如SEQ ID No.5所示，環引物LB如SEQ ID No.6所示。通過采用上述3對特異的LAMP引物對待測樣品進行LAMP擴增可實現對蘋果黑星病菌的快速檢測，該技術操作簡單、靈敏度高、特異性強，檢測速度快，適用于田間蘋果黑星病的早期診斷和病原菌的檢測與鑒定，對蘋果黑星病及時有效的防控具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及蘋果黑星病菌檢測方法技術領域，尤其涉及快速檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法。

背景技術

由蘋果黑星病菌(Venturiainaequalis)引起的蘋果黑星病，又稱瘡痂病(applescab)，是世界各蘋果產區的重要病害之一。該病害主要危害蘋果葉片和果實，也可侵染葉柄、花、萼片、花梗、幼嫩枝條和芽鱗等，嚴重時引起落葉、落果，受害果實開裂畸形，直接影響蘋果的產量及品質。蘋果黑星病具有流行速度快、危害性大、難以防治的特點。近年來，由于果園管理模式粗放，蘋果黑星病在我國蘋果主產區的發生呈抬頭趨勢。蘋果黑星病菌以菌絲體或子囊殼在芽鱗或病落葉上越冬，子囊孢子是主要初侵染源，翌年5-8月釋放子囊孢子，借風雨傳播進行侵染，春季多雨高濕有利于病害的發生。此外，蘋果黑星病菌具有潛伏侵染特性，如采收前遭遇陰雨天氣，病菌會潛伏到果實，條件適宜則引起貯藏期的蘋果果實發病。

目前，蘋果黑星病菌的檢測主要是通過分離培養病原菌，然后進行形態學特征鑒定和致病性測定結果，該方法對專業技術要求比較高，且存在一定的不確定性，且程度繁瑣、周期長。而目前的普通PCR反應對病原菌DNA進行擴增、回收和測序，檢測時間長，成本高，不能滿足經濟高效檢測的要求。因此，上述現有蘋果黑星病菌的檢測方法極大地影響了田間中蘋果黑星病病情的及時發現和實時監測。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是日本學者Notomi于2000年發明的一種新的DNA擴增技術，該方法能夠高效、特異、快速在等溫條件下完成。LAMP技術針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60分鐘左右即可實現10⁹～10¹⁰倍的核酸擴增。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子反應形成不溶的焦磷酸鎂沉淀，便于對反映結果的觀測。該方法操作簡便，結果可靠，成本低廉，在基層診斷方面有著廣泛的應用前景。

雖然環介導等溫擴增技術具有以上優點，但是由于該技術對引物特異性和條件、體系要求較高，這種檢測方式容易由于污染問題、以及環引物件的非特異性結合等導致假陽性的問題，影響檢測結果的準確性；而目前還沒有發現用于特異性檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物。

發明內容

針對上述問題，本發明實施例提供了一種快速、特異性的檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法，該方法檢測速度快、操作簡單、特異性強、靈敏度高、結果準確可靠。

本發明的技術方案如下：

本發明提供了快速檢測蘋果黑星病菌的LAMP引物，該引物由一對外引物F3和B3、一對內引物FIP和BIP以及一對環引物LF和LB組成。

其中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQ ID No.2所示，內引物FIP如SEQ ID No.3所示，內引物BIP如SEQ ID No.4所示，環引物LF如SEQ ID No.5所示，環引物LB如SEQ ID No.6所示。