[發(fā)明專利]一種小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010533705.5 | 申請日： | 2020-06-12 |
| 公開（公告）號： | CN111548984A | 公開（公告）日： | 2020-08-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李小輝;韓市陳;晏月明 | 申請（專利權(quán)）人： | 首都師范大學(xué) |
| 主分類號： | C12N5/04 | 分類號： | C12N5/04;C12N15/82 |
| 代理公司： | 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245 | 代理人： | 張立娜 |
| 地址： | 100048 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 小麥 胚乳 細(xì)胞 原生 質(zhì)體 制備 轉(zhuǎn)化 方法 | ||
1.一種制備小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟：
S1：取開花后8-11天的新鮮小麥籽粒，沿腹縫剖開，得胚乳組織；
S2：將胚乳組織置于緩沖液1中浸泡、洗滌；
S3：將洗滌過的胚乳組織置于緩沖液2中酶解，得粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體；
S4：采用冰浴靜置時(shí)間梯度沉降法處理所述粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體，得純化后小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在步驟S2中，所述緩沖溶1中的滲透壓穩(wěn)定劑為蔗糖和甘露醇，其中蔗糖的濃度為20g/L，甘露醇的濃度為130g/L；
進(jìn)一步地，所述緩沖液1的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：130g/L的D-甘露醇、20g/L的蔗糖、0.2mM的磷酸氫二鉀、1.0mM的硝酸鉀、10.0mM的二水氯化鈣、1.0mM的七水硫酸鎂、1.0μM的碘化鉀、0.1μM的五水硫酸銅以及2.0mM的pH為5.7的MES。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步驟S2中，將所述胚乳組織切成細(xì)條，置于所述緩沖液1中浸泡30-60min，然后用所述緩沖液1洗滌3-5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步驟S3中，所述緩沖液2中含有纖維素酶和離析酶；
進(jìn)一步地，所述纖維素酶在所述緩沖液2中的含量為150U/mL；所述離析酶在所述緩沖液2中的含量為15.3U/mL；
和/或
在步驟S3中，所述緩沖溶2中的滲透壓穩(wěn)定劑為蔗糖和甘露醇，其中蔗糖的濃度為20g/L，甘露醇的濃度為130g/L；
和/或
所述緩沖液2的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：150U/mL的纖維素酶、15.3U/mL的離析酶、10g/L的牛血清白蛋白(BSA)、130g/L的D-甘露醇、20g/L的蔗糖、0.2mM的磷酸氫二鉀、1.0mM的硝酸鉀、10.0mM的二水氯化鈣、1.0mM的七水硫酸鎂、1.0μM的碘化鉀、0.1μM的五水硫酸銅以及2.0mM的pH為5.7的MES。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：在步驟S3中，所述酶解為將所述胚乳組織置于所述緩沖液2中24℃避光震蕩90-120min；和/或
在步驟S3中，所述胚乳組織和所述緩沖液2的配比為0.4-0.8g：2mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步驟S3中，在將所述胚乳組織置于所述緩沖液2中酶解之后還包括如下步驟：向酶解后的體系中加入等體積的所述緩沖液1，然后用200目的細(xì)胞篩過濾至容器中，得到所述粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步驟S4按照包括如下進(jìn)行：
S41：將裝有步驟S3所得粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體的容器置于冰水浴或者置于4℃預(yù)冷10min，棄上清，去除的所述上清的量為總體積的一半；
S42：向裝有步驟S41處理后樣本的容器內(nèi)沿側(cè)壁加入所述緩沖液1，所述緩沖液1的加入量為容器內(nèi)所述粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體體積的3.5倍，混勻后冰水浴垂直靜置8min，棄上清，去除的所述上清的量為加入的所述緩沖液1的體積；
S43：向裝有步驟S42處理后樣本的所述容器內(nèi)沿側(cè)壁加入所述緩沖液1，所述緩沖液1的加入量為容器內(nèi)所述粗制小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體體積的3.5倍，混勻后冰水浴垂直靜置6min，棄上清，去除的所述上清的量為加入的所述緩沖液1的體積；
進(jìn)一步地，在步驟S43之后還包括如下步驟S44：
S44：將裝有步驟S43處理后樣本的所述容器冰水浴垂直靜置30min，去除全部上清，即得所述純化后小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體。
8.一種小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：
S5：將利用權(quán)利要求1-7中任一所述方法制備得到的小麥胚乳細(xì)胞原生質(zhì)體重懸于MMg緩沖液中；
S6：進(jìn)行PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
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