[發明專利]桔小實蠅生殖發育相關miR-286抑制劑及其應用

在審

• 申請號: 202010533559.6
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111705059A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 鄭薇薇;張芮;張宏宇;張圣鋒
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01N57/16;A01P23/00;A01P7/04
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了桔小實蠅生殖發育相關miR?286抑制劑及其應用，首次發現miR?286與桔小實蠅雌蟲的卵巢發育、產卵量有關，利用miR?286特異性抑制劑可降低miR?286的表達，與對照組相比，注射miR?286抑制劑的桔小實蠅雌成蟲卵巢形態出現明顯的發育遲緩，卵巢直徑也受抑制，單雌產卵量及產卵總量顯著降低。因此，本發明提出可通過抑制miR?286在桔小實蠅中的表達來影響桔小實蠅的正常生殖發育，降低繁殖力，從而有利于對桔小實蠅的綠色防控。

技術領域

本發明屬于害蟲生物防治和基因工程領域，具體涉及一種桔小實蠅生殖發育相關的microRNA-miR-286及其抑制劑在桔小實蠅防治中的應用。

背景技術

桔小實蠅又稱東方果實蠅，俗稱果蛆，屬雙翅目，實蠅科，果實蠅屬，是我國一種毀滅性果蔬害蟲，嚴重危害柑橘、芒果等在內的250多種水果和蔬菜。目前桔小實蠅在國外主要分布于印度、菲律賓、泰國、美國、澳大利亞等國，國內主要分布在臺灣省、香港、廣東、云南等地，可危害多種果樹的果實，造成減產甚至絕產。該蟲主要以幼蟲取食危害果實，不轉果危害；幼蟲潛居危害的特性使其難以從果實外觀察覺，常隨被害果、包裝物、運輸工具等遠距離傳播；傳入非疫區后遇到適宜環境條件即可迅速蔓延危害，對當地果蔬產業發展構成嚴重威脅，故被列為世界性檢疫害蟲。因此，桔小實蠅的防治依舊是我們需要面對的一個重要問題。

昆蟲繁殖對其物種繁衍至關重要。在種群繁衍和擴增過程中，生殖系統對于維持其種群數量及延續至關重要。兩性交配是昆蟲種群繁衍的一個重要的環節，在受到一些昆蟲的生理因素和外部生態因素的干擾后，生殖適合度會受到影響。雌性昆蟲的生殖發育主要包括卵巢發育、生殖行為和繁殖力。昆蟲的生殖發育受阻如卵巢形態異常，產卵量下降，繁殖力降低等都會造成種群數量減少，種群繁衍受阻。因此，研究昆蟲的生殖發育能夠為害蟲的綠色防控提供有力的理論基礎。

昆蟲生殖發育相關miRNA的功能研究主要集中在果蠅、埃及伊蚊、家蠶和德國小蠊中，在其他非模式昆蟲中的研究主要包括測序、生物信息學分析和靶基因預測三個方面，有關生殖發育相關miRNA的系統鑒定和功能研究依然空缺。近年來，桔小實蠅生長發、變態和性別偏向相關miRNA的研究方面取得了一定的進展，但很少有研究側重于桔小實蠅和其他實蠅中雌性生殖相關miRNA的鑒定和功能研究。因此，有必要在更多物種，尤其是幾種重要的農業害蟲中，鑒定并明確更多與生殖有關的miRNA。

在之前的研究中，miR-286被發現在根結線蟲的卵中高表達(Subramanian et al2016)；miR-286a和miR-286b在蚊子持續感染登革熱病毒的過程中維持病毒復制和抗病毒反應之間的平衡(Avila-Bonilla et al 2017)；白紋伊蚊中miR-286b的耗盡會導致孵化率降低，表明其在胚胎發生中的作用(Puthiyakunnon et al 2013)，然而其在生殖發育中的功能尚不清楚。據此，發明人深入研究miR-286在桔小實蠅生殖發育中的功能，包括其對卵巢發育、產卵量等的影響。通過觀察注射 miR-286抑制劑后桔小實蠅雌成蟲的卵巢形態以及產卵量等生殖力指標，證實了 miR-286在桔小實蠅雌蟲生殖發育中發揮重要的調控作用，而下調miR-286會引起卵巢發育遲緩、產卵量降低和繁殖力下降等現象。這些實驗結果證明，miR-286 在桔小實蠅生殖發育中的作用為桔小實蠅的防控提供了有力的理論基礎。

發明內容

針對桔小實蠅綠色防控的問題，本發明提供了桔小實蠅生殖相關的miR-286 及其抑制劑，利用miR-286特異性抑制劑可降低miR-286的表達，通過抑制劑下調miR-286會引起卵巢發育遲緩、產卵量降低和繁殖力下降，從而有利于對桔小實蠅的綠色防控。

為了實現上述目的，本發明采用以下措施：

桔小實蠅生殖發育相關miR-286成熟體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其抑制劑的序列如SEQ ID NO.2所示。