[發明專利]一種蛋白單磷酸尿苷酸化修飾的檢測方法

在審

• 申請號: 202010533277.6
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111505001A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 李冰清;楊銀龍;岳盈盈;宋楠楠;李翠玲
• 申請（專利權）人: 山東省醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/28;G01N1/30;G01N33/68
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 申星宇

本發明公開了一種蛋白單磷酸尿苷酸化修飾的檢測方法，本方法使用生物素標記的UTP(Biotin?16?UTP)為原料，在單磷酸尿苷酸轉移酶YdiU作用下，發生UMP化修飾的蛋白同時也帶有生物素標記。后續使用生物素?鏈酶親和素印跡法驗證待測蛋白是否具有生物素標記。本發明具有簡易，方便，高靈敏性等特點，可用于高通量篩選原核及真核細胞內發生單磷酸尿苷酸化的蛋白，結合質譜檢測可確定修飾位點，為蛋白尿嘧啶單核苷酸化修飾的研究提供有效的鑒定和研究手段。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體地說，是涉及一種蛋白單磷酸尿苷酸化修飾的檢測方法。

背景技術

蛋白質是生命活動的承擔者，蛋白質翻譯后修飾可調控多種生命活動，其失調可造成癌癥等多種疾病。其中，蛋白尿嘧啶單核苷酸化修飾(UMP化，UMPylation)于1975年首次在大腸桿菌中鑒定到，但UMP化修飾的底物蛋白僅限于谷氨酸合成酶體系，導致UMP化修飾一直未收到重視，盡管已發現四十多年，相應的修飾檢測方法并未建立。隨著蛋白修飾組學技術發展，近年來超過40個UMP化修飾的蛋白被鑒定出來，說明UMP化修飾在細菌生命活動的調控中起到重要的作用。由于缺少富集分離的方法，只有豐度很高的蛋白被鑒定到UMP修飾，保守估計細胞中可發生UMP化修飾的蛋白將是現有的十倍(400個以上)。尋找并鑒定細胞內可發生UMP化修飾的蛋白將為這一新型翻譯后修飾研究提供關鍵基礎。因此需要一種能有效解決上述問題的蛋白單磷酸尿苷酸化修飾的檢測方法及應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種蛋白單磷酸尿苷酸化修飾的檢測方法及應用，

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明包括以下步驟：

A將YdiU蛋白及底物加入到反應體系后，混勻后加入Biotin-16-UTP 1μl，30-40℃反應1小時；

B反應樣品加入上樣緩沖液后，使用12％的SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后樣品通過轉膜到硝酸纖維素膜上后使用對染色劑全蛋白進行染色；

C將含有樣品的所述醋酸纖維素膜加入稀釋后的辣根過氧化酶-親和素抗體室溫孵育30-60分鐘；

D洗膜并封閉5min-10min后即可使用ECL顯色液顯影。顯影出的即為被單磷酸尿苷酸化修飾的蛋白。

進一步地，所述底物采用GroEL191aa-376aa蛋白作為陽性對照。

進一步地，所述染色劑為麗春紅。

進一步地，所述反應體系如下：

YdiU蛋白1μl(約0.5μM)

待測底物或陽性對照4μl(約4μM)

Biotin-16-UTP 1μl(終濃度0.5mM/L)

反應buffer 14μl

進一步地，所述修飾反應用到的生物素標記的UMP供體Biotin-16-UTP的分子結構如下所示：

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明具有簡易，方便，高靈敏性等特點，可用于高通量篩選原核及真核細胞內發生單磷酸尿苷酸化的蛋白，結合質譜檢測可確定修飾位點，為蛋白尿嘧啶單核苷酸化修飾的研究提供有效的鑒定和研究手段。

附圖說明

圖1為本發明的反應流程圖、

圖2為實施例子中的鑒定前的鑒定前麗春紅染色結果；

圖3為實施例子中的修飾后顯影結果；

具體實施方式