[發明專利]一種軟組織胞外囊泡的提取方法及應用有效
| 申請號： | 202010533003.7 | 申請日： | 2020-06-12 |
| 公開（公告）號： | CN111621471B | 公開（公告）日： | 2022-03-11 |
| 發明（設計）人： | 喬鞠;廖立;黃海森;陳國慶 | 申請（專利權）人： | 成都世聯康健生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/077 | 分類號： | C12N5/077;C12N5/073;A61K8/99;A61K35/34;A61K35/51;A61K35/50;A61K47/46;A61Q19/00 |
| 代理公司： | 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214 | 代理人： | 易小藝 |
| 地址： | 610000 四川省成都市高*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 軟組織 胞外囊泡 提取 方法 應用 | ||
1.一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：包括以下步驟：
（1）獲取目標軟組織，清洗后剪碎成小塊；其中清洗前將軟組織放入組織保存液中保存，保存溫度2～8℃，72h內處理；所述組織保存液為1～5mL青霉素/鏈霉素溶液加入100mL生理鹽水或α-MEM基礎培養基中混合而得；
（2）將剪碎后的組織塊轉移至懸浮培養瓶中，加入基礎培養基，放在培養箱中培養，磁力攪拌器速度為50～500rpm，培養溫度37℃，培養時間為1～96h；
所述組織塊與基礎培養基質量體積比例為1:1～30；質量濃度為5%的CO2培養箱中培養；
（3）將組織培養上清轉移至離心管中，溫度3~5℃，500~3000g離心5～30min；離心后將組織培養上清用40～100μm篩網過濾，然后再用0.40~0.5μm濾器進行過濾；
（4）將過濾后組織培養上清轉移至超濾管中，溫度3~5℃，2000~10000g離心20～50min，得截留液；
（5）加入截留液至層析柱中層析，收集組分；加入截留液至層析柱中，以生理鹽水作為流動相，每個組分1min，收集第5～11個組分；
（6）收集步驟（5）中層析后的截留液，置于-82~-78℃保存，即得；
所述軟組織為小鼠肌肉組織、豬肌肉組織或人臍帶組織。
2.根據權利要求1所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述基礎培養基為α-MEM混合培養基。
3.根據權利要求1所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步驟（4）中將收集的組分轉移至100KDa的超濾管中，溫度3~5℃；再2000~10000g離心20～50min，離心后分裝、置于低溫中保存。
4.根據權利要求3所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步驟（4）中將收集的組分轉移至100KDa的超濾管中，溫度4℃。
5.根據權利要求1所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步驟（3）和步驟（4）中溫度為4℃。
6.根據權利要求1所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步驟（3）中用0.45μm濾器進行過濾；所述步驟（6）中置于-80℃保存。
7.根據權利要求1所述的一種軟組織胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述方法中提取的軟組織胞外囊泡直徑介于10～250nm之間，平均直徑為114±8nm。
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