[發明專利]草木樨LTR-RT和miRNA-SSR分子標記引物及在種質鑒定中的應用

有效

• 申請號: 202010532315.6
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111549171B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 張吉宇;歐陽子鳳;吉賽爾;馬甜甜;張正社
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京集知天成知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11681
• 代理人: 袁瑞紅

本發明屬于生物技術領域，具體涉及草木樨LTR?RT(長末端重復反轉錄轉座子)、miRNA?SSR分子標記引物及在草木樨屬種質鑒定中的應用。具體分別采用47對LTR?RT引物或66對miRNA?SSR引物對草木樨屬18個種40份種質進行區分，兩種方法均可利用較少的引物組合在短時間內完成對供試草木樨屬種質的比對鑒定，具有準確、高效、快速、成本低以及操作方便等優勢，兩種方法均具有較高的靈敏度和精確度。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及草木樨分子標記引物(包括LTR-RT分子標記引物和miRNA-SSR分子標記引物)及在草木樨屬種質鑒定中的應用。

背景技術

白花草木樨(Melilotus?albus)是豆科草木樨屬一年生或兩年生牧草，栽培面積僅次于紫花苜蓿(Medicago?sativa)，適宜在濕潤和半干燥氣候地區生長。其具有生命力強、耐干旱、耐貧瘠、耐寒冷、生長快等特點。在苜宿難以生存的地方，仍能良好生長。全屬植物約19種，主要分布于中亞、歐洲和北非。我國有7種。該屬植物經濟價值較高，是優良的牧草和中國北方農業和畜牧業極為重要的綠肥作物；此外，草木樨中主要有效成分為香豆素，具有生物活性，可作為一種煙草香料；在民間常制成軟膏，治療外傷，或煎服用于浮腫、腹痛等癥。由于其適應性強，也是水土保持和改良天然草場的重要植物資源。同時，由于草木樨屬種質分布范圍廣，在不同生境中形成了繁多的生態型，不同生境包括不同的經緯度和起源等要素，這些都構成了草木樨屬種質的遺傳多樣性。此前，國內外學者主要通過形態學和細胞學特征對草木樨屬種質進行鑒定，多偏重于對花色、種間雜種后代減數分裂行為的觀察，以及不同種質核型染色體大小的比較分析，但是通過形態學特征往往不能準確區分各生態型，細胞學觀察又太過費時費力。因此，建立一套快速、精確、廉價的草木樨屬種質精準鑒定技術是非常必要的。

隨著現代分子生物學的發展，分子標記越來越多的被應用于品種鑒定中，如以PCR反應為基礎的SSR、miRNA-SSR、ILP、LTR-RT相關分子標記(RBIP、IRAP、ISBP、REMAP)等。LTR-RT序列在植物基因組中的廣泛分布、可轉移、較強的序列保守性都使其適合作為分子標記。與其它分子標記相比，LTR-RT相關標記具有基因組覆蓋度廣、靈敏度高、多態性豐富和插入突變穩定等優點，可廣泛用于品種鑒定、系統發育分析、遺傳多樣性分析以及遺傳連鎖作圖等方面；SSR標記具有較強的共顯性、豐富性以及高信息含量，位于miRNA基因區域的SSR標記可以用作“功能遺傳標記”，廣泛用于標記輔助育種和基因組選擇。

作為新型的分子標記，迄今為止，LTR-RT相關標記主要在藍莓、櫻桃以及大麥等少數植物中得到開發并主要應用于種質鑒定和遺傳連鎖圖譜構建。如Yinghai?Liang等利用LTR-RT相關標記研究了18份櫻桃種質的遺傳多樣性(參見《Molecular?Breeding》，2016年，《Development?of?retrotransposon-based?molecular?markers?and?their?applicationin?genetic?mapping?in?chokecherry(Prunus?virginianaL》)；miRNA-SSR分子標記主要在水稻、狗尾草以及蕓苔屬等少數植物中得到開發并主要應用于遺傳多樣性分析和種質鑒定。如Chandra?Bhan?Yadav等利用miRNA-SSR分子標記研究了18份小米種質的遺傳多樣性(參見Molecular?Breeding》，2014年，《Development?of?novel?microRNA-based?geneticmarkers?in?foxtail?millet?for?genotyping?applications?in?related?grassspecies》)。但在非模式植物草木樨中，LTR-RT以及miRNA-SSR相關標記的開發以及在品種鑒定中的應用尚未見報道。因此，在全基因組水平開發白花草木樨LTR-RT以及miRNA-SSR相關分子標記并研究其在草木樨屬種質鑒定中的應用，對草木樨屬種質鑒定以及分子標記輔助育種具有重要意義。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：