[發(fā)明專利]基于結(jié)構(gòu)光照明和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法和裝置

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• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN111781174A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡翠方;王玥穎;劉文杰;袁逸凡;劉旭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G02B21/00;G02B21/36
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

本發(fā)明公開了一種基于結(jié)構(gòu)光照明和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法和裝置，該裝置包括結(jié)構(gòu)光照明模塊和超臨界角熒光探測模塊，結(jié)構(gòu)光照明模塊用于產(chǎn)生條紋照明激發(fā)樣品，超臨界角熒光探測模塊通過超臨界角熒光強(qiáng)度隨染料分子距分界面距離的指數(shù)衰減變化關(guān)系還原每個(gè)像素點(diǎn)的軸向位置信息。本發(fā)明裝置簡單，操作方便；照明光能量不高，不易漂白樣品；成像速度快，可用于觀察活細(xì)胞；所需熒光標(biāo)記密度較低且無需特異熒光染料，應(yīng)用范圍廣；無需層切，僅通過對(duì)二維圖像的算法處理還原三維信息，可快速有效的實(shí)現(xiàn)三維空間內(nèi)的高分辨率顯微成像。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及光學(xué)超分辨顯微成像領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于結(jié)構(gòu)光照明和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法和裝置。

背景技術(shù)

光學(xué)顯微鏡是生命科學(xué)等領(lǐng)域用于觀察研究微觀結(jié)構(gòu)的重要手段。但是由于光的衍射效應(yīng)和光學(xué)系統(tǒng)的有限孔徑，普通光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在半波長左右，無法對(duì)小于200納米尺度的樣品進(jìn)行探測。

為了突破這個(gè)限制，科學(xué)家們提出了多種超分辨成像技術(shù)方法，來實(shí)現(xiàn)對(duì)納米級(jí)的微小結(jié)構(gòu)的觀察研究。其中一種是受激發(fā)射損耗顯微術(shù)，該技術(shù)通過高功率的損耗光使部分被激發(fā)的熒光分子受激輻射而猝滅，從而降低自發(fā)輻射的熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的寬度，來實(shí)現(xiàn)超分辨率顯微成像。但是該技術(shù)需要熒光標(biāo)記密度較高且需要特異熒光染料，同時(shí)高功率的損耗光非常容易漂白樣品。另一類技術(shù)如隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)和光激活定位顯微鏡，運(yùn)用單分子定位技術(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像。這類技術(shù)需要使用高強(qiáng)度的激光漂白已被正確定位的分子，且需循環(huán)上百次才能得到最終結(jié)果。所以這一類技術(shù)除了也存在和之前受激發(fā)射損耗顯微術(shù)相同的限制以外，更具有因?yàn)槌上袼俣嚷鵁o法觀測分子動(dòng)態(tài)的缺點(diǎn)。

結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡不同于之前提到的兩類顯微鏡，它通過改變照明系統(tǒng)，在樣品表面投射條紋，通過調(diào)制樣品的空間頻率來采集包含樣品細(xì)節(jié)的高頻信息，再通過后期算法還原，來實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡相比受激發(fā)射損耗顯微鏡和單分子定位技術(shù)，有著無需高熒光標(biāo)記密度和特異熒光染料成像速度快，入射光功率低不易漂白，成像速度快可實(shí)時(shí)觀測等優(yōu)點(diǎn)。但是二維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡只能獲取二維圖像，還原樣品的橫向分布信息，而無法得到準(zhǔn)確的軸向結(jié)構(gòu)信息，通過層切實(shí)現(xiàn)的三維結(jié)構(gòu)光顯微鏡又無法實(shí)現(xiàn)快速成像，這限制了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于結(jié)構(gòu)光照明和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法和裝置，可實(shí)現(xiàn)三維超分辨顯微成像。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的基于結(jié)構(gòu)光照明和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法包括以下步驟：

1)激光束進(jìn)入可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光照明的照明系統(tǒng)，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光圖樣后投射在樣品表面照明激發(fā)樣品；

2)通過顯微物鏡收集樣品受激發(fā)出的熒光信號(hào)，用分束鏡分為兩路光線，第一路光完整投射在工業(yè)相機(jī)上，另一路光經(jīng)過放置在物鏡等效后焦面上的光闌再投射在另一個(gè)工業(yè)相機(jī)上；

3)旋轉(zhuǎn)照明結(jié)構(gòu)光圖樣的條紋方向或移動(dòng)條紋得到多幅圖樣，對(duì)第一路工業(yè)相機(jī)采集到的多幅圖像進(jìn)行結(jié)構(gòu)光照明重構(gòu)得到一幅橫向超分辨圖像，即為樣品的二維超分辨圖像；

4)對(duì)兩路工業(yè)相機(jī)采集得到的多幅圖像分別疊加，得到兩張均勻?qū)拡稣彰飨碌臉悠穲D片，其中第一路工業(yè)相機(jī)圖片疊加結(jié)果中包含了樣品熒光的超臨界角熒光分量和亞臨界角熒光分量，而第二路工業(yè)相機(jī)圖片疊加結(jié)果僅包含樣品熒光中的亞臨界角熒光分量，根據(jù)疊加得到的兩幅超分辨圖像得到歸一化后的樣品染料分子超臨界角熒光的強(qiáng)度分布，通過超臨界角熒光強(qiáng)度隨染料分子距分界面距離的指數(shù)衰減變化關(guān)系還原每個(gè)像素點(diǎn)的軸向位置信息；

5)將還原的軸向位置信息與步驟3)獲得的二維超分辨圖像相結(jié)合，得到樣品的三維分布信息。