[發(fā)明專利]基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法和裝置

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• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111781173A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設計）人: 匡翠方;王玥穎;袁逸凡;劉文杰;劉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00;G02B21/36;G02B27/58
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

1.一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)照明光激光器以寬場光對樣品進行照明激發(fā)。

2)損耗光激光器產生激光進入使用電光調制器移相的受激發(fā)射損耗顯微損耗模塊，產生并行的損耗光圖樣后投射在樣品表面。

3)通過顯微物鏡收集樣品受激發(fā)出的熒光信號，用分束鏡分為兩路光線，第一路光完整投射在工業(yè)相機上，第二路光經過放置在物鏡等效后焦面上的光闌再投射在另一個工業(yè)相機上。

4)移動并行損耗光圖樣對照明范圍內的樣品進行掃描，對兩路工業(yè)相機采集到的多幅圖像分別進行對應的針孔濾波；對第一路光采集到的圖像結果進行反卷積后疊加，即為樣品的二維超分辨圖像結果。

5)對步驟4)中針孔濾波后的兩組圖像，其中第一路光的圖像包括樣品的超臨界角熒光分量和亞臨界角熒光分量，第二路光的圖像僅包括樣品的亞臨界角熒光分量；根據(jù)這兩組圖像得到歸一化后的樣品染料分子超臨界角熒光的強度分布，通過超臨界角熒光強度隨染料分子距分界面距離的指數(shù)衰減變化關系還原每個針孔中心點的軸向位置信息。

6)將還原的軸向位置信息與步驟4)獲得的二維超分辨圖像相結合，得到樣品的三維分布信息。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法，其特征在于，所述照明光激光器使用波長638納米的激光，損耗光激光器使用波長775納米的激光。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法，其特征在于，步驟3)中光闌的大小滿足ρ＝n_ofsinθ_c，其中n_o是顯微物鏡浸入介質的折射率，f是物鏡的焦距，θ_c＝arcsin(n_m/n_g)，其中n_m為樣品介質的折射率，n_g為玻璃界面的折射率。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法，其特征在于，對于離平面較遠的熒光分子的探測光，其中只包含亞臨界角熒光成分而不包含超臨界角熒光成分，由一個放置在物鏡等效后焦面上的CCD獲取亞臨界角熒光的角分布直徑大小，再根據(jù)角分布直徑大小設計光闌直徑大小，再把CCD替換成光闌，將光闌放入光路中，調整光闌位置使得光闌與光路共軸。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像方法，其特征在于，步驟5)中，根據(jù)針孔濾波后的圖像得到歸一化后的樣品染料分子超臨界角熒光的強度分布，具體為：對步驟4)中每一張圖像，圖像上每一個針孔對應的范圍內的所有點的平均值即為這個針孔中心點的測量值，對第一路光圖像和第二路光圖像的測量值分別疊加成完整圖像，用第一路光的測量結果與第二路光的測量結果做差分，得到樣品熒光的超臨界角熒光分量，再用該差分結果除以第二路光的測量結果，得到歸一化后的超臨界角熒光比值分布，其隨樣品分子離開分界面的軸向距離成指數(shù)遞減。

6.一種基于并行STED和超臨界角成像的三維超分辨顯微成像裝置，其特征在于，包括：

橫向超分辨模塊即并行受激發(fā)射損耗顯微鏡：包括用于產生激發(fā)光的照明光激光器；用于產生損耗光的損耗光激光器；用于傳輸激光的單模光纖；用于反射和準直的透鏡組；用于產生并行損耗光圖樣的并行受激發(fā)射損耗顯微損耗模塊；

軸向超分辨模塊：包括用于收集樣品發(fā)出的熒光信號的顯微物鏡；用于透射照明光，反射熒光信號的二向色鏡；用于獲取軸向位置信息的超臨界角熒光探測模塊，包括用于獲取物鏡等效后焦面的4f透鏡組，用于分束的半透半反鏡，用于限制光束的光闌，用于濾去雜散光的濾波片，用于將樣品熒光信號成像的透鏡，用于接收樣品熒光信號的工業(yè)相機。