[發明專利]一種基于回音壁模式光學微腔的外泌體檢測方法

在審

• 申請號: 202010526595.X
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111999270A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 王秀紅;索明倩
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/543;G01N33/58;G01N33/533
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.一種基于回音壁模式光學微腔的外泌體檢測方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

步驟1：搭建檢測裝置，在光學平臺固定納米脈沖激光器，使發射光束水平發射，光束經過衰減片，用于調節發射到樣品表面的光強，然后經過銀鏡，將光束路徑改變成與原方向成直角，目的是增大搭建空間方面后面光路的搭建，沿著光束方向加入二向色鏡，使反射光束與原光束平行，沿著反射光束方向，首先固定一個40倍顯微物鏡，使光束準直通過，然后沿著光束方向在40倍物鏡后面固定一個60倍顯微物鏡，使兩個顯微物鏡的距離為兩物鏡的焦距距離之和，即焦點重合，實驗過程中，將樣品放在兩物鏡的焦點重合處，用于激發微腔，接著在60倍物鏡后固定一個濾波片，用于過濾掉泵浦光和雜散光，在濾波片后面固定一個聚焦透鏡，用于收集熒光和激光，更高效的傳輸到聚焦透鏡后面的光譜儀的接收器光纖探頭上；在聚焦透鏡后面沿著透射光束方向固定一個聚焦透鏡，用于將像呈現在后面的CCD相機上面，觀察光束作用在微腔表面的情況；

步驟2：激光入射到尺寸為幾至幾十微米的回音壁微腔中，在摻雜熒光物質的微腔內部發生全反射，當全反射光程是波長整數倍時候，使之形成諧振腔，而光在其中滿足增益大于損耗的條件時，形成用于檢測的回音壁模式微腔；

步驟2：對表面已修飾羧基或氨基且摻雜熒光物質的回音壁微腔處理，這一步驟主要是將具有氨基或羧基修飾的適體，或者是氨基或羧基修飾的特異性抗體蛋白，與對應的表面羧基或者氨基修飾的回音壁微腔混合反應，通過氨基和羧基的自動共價偶聯使目標檢測物與微腔表面的修飾物識別并結合；

步驟3：將連接適體的或連接特異性抗體蛋白的回音壁微腔與外泌體一起孵育，微腔表面連接成功的適體或特異性抗體蛋白與相應的外泌體表面的特有的蛋白質發生堿基互補配對的特異性識別并結合；

步驟4.用激光器照射微腔，外泌體與微腔連接成功后經過離心，洗去未連接成功的外泌體和微腔后懸浮于pH＝7.4的PBS緩沖液中，將與外泌體連接成功的微腔滴加在載玻片上，然后把載玻片放在光路中，通過調節載玻片的位置使激光束聚焦耦合進微腔內，首先，使用衰減片調節光束強度,使其達到激發閾值激發出熒光的ASE信號，然后轉動衰減片，使發射到微腔表面的光功率以每次增大5μW的光功率增大光強，使其在回音壁模式下發出激光，外接光譜儀和CCD裝置，用于接收光譜信號和對微腔與外泌體結合成像。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，熒光物質為熒光染料、量子點或者熒光蛋白。

3.根據權利1要求所述的檢測方法，其特征在于，表面處理的具體方法包括特異性抗體蛋白修飾或者相關檢測適體修飾。

4.根據權利1要求所述的檢測方法，其特征在于，回音壁微腔物質選用包括：表面修飾羧基或氨基的微腔。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，激光光源的選擇：納米脈沖激光器，檢測物質為各種細胞產生的細胞分泌物外泌體。