[發明專利]用于檢測食品中甲型肝炎病毒恒溫擴增的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010526079.7
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111690771A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 陳莉麗;曹際娟;鄭秋月;楊莉莉
• 申請（專利權）人: 中聯瑞（北京）生物科技有限責任公司;大連民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種用于檢測食品中甲型肝炎病毒恒溫擴增的引物組，其特征在于，其包括外引物OF、外引物OB、內引物IF、內引物IB、環引物LF和環引物LB，其中，所述外引物OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外引物OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述內引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述內引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述環引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述環引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一種用于檢測食品中甲型肝炎病毒恒溫擴增的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權利要求1所述的引物組。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2×恒溫擴增反應緩沖液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆轉錄酶。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括陽性對照和空白對照，所述陽性對照為含如SEQ ID NO.8所示序列的質粒體外轉錄RNA，所述空白對照為去核酸的超純水。

5.一種用于檢測食品中甲型肝炎病毒恒溫擴增的熒光檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：

S1、從樣品中提取RNA；

S2、對步驟S1提取的所述RNA進行恒溫擴增；其中，在反應體系中，采用如權利要求1所述的用于檢測食品中甲型肝炎病毒恒溫擴增的引物組；

S3、結果判定：

若有“S”型熒光信號擴增曲線，Ct值35，則判斷為陽性；

若無“S”型熒光信號擴增曲線，無Ct值或Ct值45則判斷為陰性；

若Ct值在35-45之間，建議重復實驗；

若Ct值45，熒光信號擴增曲線有明顯起峰，該樣品判斷為陽性，否則為陰性。

6.根據權利要求5所述的熒光檢測方法，其特征在于，在步驟S2中，在步驟S2中，所述恒溫擴增的反應體系25μL，其中，所述反應體系中含有終濃度為：1×恒溫擴增反應緩沖液，0.34×TB Green，65U的BcaBEST酶，1U的AMV逆轉錄酶，0.2μM的外引物OF和外引物OB，1.6μM內引物IF和內引物IB，0.8μM環引物LF和環引物LB；加入RNA模板1.0μL。

7.根據權利要求5所述的熒光檢測方法，其特征在于，在步驟S2中，所述恒溫擴增的反應體系25μL，具體如下：反應總體積為25μL，其中，所述反應體系中含有：2×反應緩沖液12.5μL，34×TB Green 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆轉錄酶0.2μL，10μM外引物OF/OB 0.5μL，40μM內引物IF/IB 1μL，20μM環引物LF/LB 1μL，樣品RNA模板1.0μL，其余為去核酸的超純水補足25μL。

8.根據權利要求5所述的熒光檢測方法，其特征在于，在步驟S2中，所述恒溫擴增的程序為63℃條件下反應45min。

9.根據權利要求5所述的熒光檢測方法，其特征在于，在步驟S2中，同時設置以如SEQID NO.8所示序列的質粒體外轉錄RNA為陽性對照，以去核酸的超純水為空白對照進行檢測。