[發(fā)明專利]一種用于母豬早期妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010525872.5
• 申請(qǐng)日: 2020-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN111500749B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃濤;高若男;李濤;邱梅玉;謝蘇;孫義姍;和軍飛;公紅斌;陳鑫;李清春;盧世豪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開一種用于母豬早期妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用，外泌體miRNA分子標(biāo)志物包括ssc?miR?192、ssc?miR?146a?5p和ssc?miR?149，單獨(dú)使用血清外泌體miRNA診斷區(qū)分早期妊娠與未妊娠母豬時(shí)，ROC曲線下面積(AUC)分別為0.863、0.885、0.857；ssc?miR?192、ssc?miR?146a?5p聯(lián)合AUC為0.921；ssc?miR?192、ssc?miR?149聯(lián)合AUC為0.902；ssc?miR?146a?5p、ssc?miR?149聯(lián)合AUC為0.910，ssc?miR?192、ssc?miR?146a?5p、ssc?miR?149三種miRNA聯(lián)合時(shí)，其AUC為0.959，可見，本發(fā)明提供的外泌體miRNA分子標(biāo)志物在早期母豬妊娠診斷中具有高靈敏度及高特異性，使用多個(gè)miRNA標(biāo)志物聯(lián)合，具有優(yōu)越的診斷性能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)診斷領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種用于母豬妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

外泌體(Exosomes)是細(xì)胞產(chǎn)生釋放到細(xì)胞外環(huán)境大小為30-100nm的囊泡，普遍存在于動(dòng)物的唾液、血液、尿液及乳汁等流體中。microRNAs(miRNA)是短鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度約為19-22個(gè)核苷酸，通過與mRNA的3'-UTR區(qū)內(nèi)部分或全部序列互補(bǔ)發(fā)揮調(diào)控作用，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄抑制，從而參與動(dòng)物的胚胎發(fā)育。miRNA存在于外泌體的獨(dú)特形式使之成為理想的生物標(biāo)志物。研究表明，Exosomes作為細(xì)胞外miRNA的一種運(yùn)載形式，可以保護(hù)其內(nèi)miRNA免受核糖核酸酶的降解，使得miRNA在Exosomes中高度穩(wěn)定表達(dá)。Exosome中的miRNA擁有獨(dú)特的介導(dǎo)細(xì)胞間通信的作用，可以特異性抑制細(xì)胞中與其對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)。Exosomes中miRNA的在體液中獨(dú)特穩(wěn)定性和時(shí)空特異性使之成為理想的新型生物標(biāo)志物逐漸進(jìn)入人們的視野中。

母豬的妊娠診斷一直以來都受到企業(yè)的重視，因?yàn)樵缙谌焉锏臏?zhǔn)確診斷不僅可以縮短母豬的非生產(chǎn)天數(shù)(NPD)，而且還可以提高年產(chǎn)窩仔數(shù)和增加窩均斷奶仔豬數(shù)。如何通過有效而準(zhǔn)確的診斷方法發(fā)現(xiàn)未妊娠母豬，縮短胎次間隔以及減少非生產(chǎn)天數(shù)(NPD)一直困擾著養(yǎng)豬業(yè)。

現(xiàn)有的妊娠診斷方法存在著各自的缺陷，如超聲波診斷受使用者的經(jīng)驗(yàn)程度及其檢測(cè)天數(shù)較長(zhǎng)的影響；依據(jù)母豬發(fā)情周期以及妊娠征狀診斷，可能會(huì)存在假發(fā)情現(xiàn)象；激素測(cè)定則存在一定的危險(xiǎn)性。目前還沒有一種能在妊娠早期(特別是妊娠21天以內(nèi)，即配種后未妊娠母豬能再次發(fā)情的時(shí)間)進(jìn)行妊娠診斷的有效方法進(jìn)入實(shí)用階段。鑒于以上診斷方法存在的缺陷，我們迫切的需要找到一種更為簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的妊娠診斷方法應(yīng)用于生產(chǎn)管理。

目前關(guān)于母豬妊娠早期妊娠外泌體miRNA的研究較少，普遍存在特異性和靈敏度低、診斷價(jià)值低的問題，如何通過研究外泌體miRNA，對(duì)血清外泌體miRNA作為妊娠診斷分子標(biāo)志物的研究對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中用于母豬早期妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物的特異性和靈敏度低、診斷價(jià)值低的技術(shù)問題，本發(fā)明旨在于提供一種用于母豬早期妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種用于母豬早期妊娠診斷的外泌體miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明收集了14天配種妊娠與未妊娠母豬外周血樣本，通過采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析方法，對(duì)妊娠與未妊娠母豬樣本中差異外泌體miRNA進(jìn)行篩選，最終獲得了3個(gè)與母豬早期妊娠密切相關(guān)的外周血中外泌體miRNA，即ssc-miR-192、ssc-miR-149和ssc-miR-146a-5p，選擇3個(gè)外泌體miRNA中的任意一個(gè)或兩個(gè)以上的組合，在配種后妊娠與未妊娠母豬血清樣本中的表達(dá)量均存在顯著差異并通過Real-time PCR驗(yàn)證，最終證明本發(fā)明提供的ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149與母豬早期妊娠高度相關(guān)，能夠作為快速檢測(cè)母豬早期妊娠的標(biāo)志物，該種血清外泌體miRNA標(biāo)志物具有良好的診斷指標(biāo)的特性。