[發(fā)明專利]一種低成本、高通量間接量化蛋白表達(dá)水平的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010524026.1
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111635935A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李林;朱萬超;梁焰;陳思佳
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/10
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 尹小燕

1.一種低成本、高通量間接量化蛋白表達(dá)水平的方法，其特征在于，包括以下步驟：

利用Ribosome profiling技術(shù)，通過超高速梯度密度離心，分離核糖體-RNA復(fù)合物；分離純化RNA；構(gòu)建測序文庫、結(jié)合3’端測序技術(shù)對純化后的每條RNA的3’端進(jìn)行測序。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低成本、高通量間接量化蛋白表達(dá)水平的方法，其特征在于：所述構(gòu)建測序文庫、結(jié)合3’端測序技術(shù)對純化后的每條RNA的3’端進(jìn)行測序步驟包括利用帶Oligo dT的磁珠提純mRNA，然后基于SMART反轉(zhuǎn)錄原理進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄；之后，獲取cDNA雙鏈；Tn5酶切，富集RNA 3’端；以回收的3’端產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增純化獲得300-600bp的文庫；測序，間接量化蛋白表達(dá)水平。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種低成本、高通量間接量化蛋白表達(dá)水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反轉(zhuǎn)錄原理進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄步驟中涉及的引物序列包括：

Ad1 cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；

Ad2-1 ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-2 ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-3 ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-4 ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-5 ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-6 ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-7 ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-8 ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-9 ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-10 ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-11 ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-12 ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種低成本、高通量間接量化蛋白表達(dá)水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反轉(zhuǎn)錄原理進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄步驟中涉及的反應(yīng)體系包括：2.75ul RNA，0.5ul Ad2引物(50uM)，0.5ul dNTP(10mM)；置于65℃變性5分鐘，然后放回冰上超過1分鐘；之后，向其中加入RNase inhibitor(40U/ul)0.25ul，SuperScript IV first-strandbuffer(5X)2ul，DTT(100mM)0.5ul，Betaine(5M)2ul，氯化鎂(1M)0.06ul，Ad1引物(50uM)1ul，SuperScript IV reverse transcriptase(200U/ul)0.5ul；所述Ad2引物為權(quán)利要求3中所述的Ad2-1至Ad2-12引物中的一條。