[發明專利]一種復方銀花解毒藥物在制備抗病毒藥物中的應用

在審

• 申請號: 202010523463.1
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111603526A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 王書源
• 申請（專利權）人: 天長億帆制藥有限公司
• 主分類號: A61K36/88
• 分類號: A61K36/88;A61P31/16;A61P31/14;A61P11/00;A61P31/12;A61K49/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 龍凱

1.一種復方銀花解毒藥物在制備抗病毒藥物中的應用，其特征在于：其中藥物組合的原料由青蒿17重量份、山銀花14重量份、荊芥12重量份、薄荷5重量份、野菊花17重量份、大青葉17重量份、連翹12重量份、鴨跖草22重量份、淡豆豉12重量份、前胡12重量份，所述藥物的劑型為顆粒劑、片劑、硬膠囊劑、丸劑，所述病毒包括H1N1甲型流感病毒、冠狀病毒、H7N9禽流感病毒、H5N1亞型禽流感病毒、H3N2亞型人流感病毒、H9N2亞型禽流感病毒、病毒性肺炎，所用冠狀病毒毒株類型為HCoV-229E和HCoV-0C43。

2.根據權利要求1所述的一種復方銀花解毒藥物在制備抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述應用的實施步驟如下：

a、制備原藥：精確稱取復方銀花解毒藥物干粉，采用滅菌超純水配置成100mg/ml的藥液作為受試藥母液，凍存于-20℃冰箱備用，用時用DMEM細胞維持液，稀釋成2mg/ml的起始濃度，過濾除菌后，按2倍稀釋成6-8個系列的終濃度備用,所述DMEM細胞維持液的成分為1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和鏈霉素組合而成；

b、病毒毒力的測定：將不同亞型流感病毒種毒尿囊液連續作10倍梯度濃度稀釋，將不同稀釋度的病毒接種于MDCK細胞中，于35℃吸附1h后，后換用維持液繼續培養，設正常細胞對照，每稀釋度4個復孔，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變，記錄病變程度和孔數，將細胞病變率達50％及以上的培養孔計為病變孔，然后通過血凝試驗測試細胞上清中各稀釋度子代病毒的釋放情況，72小時后取上清，采用甲醛固定細胞板，采用結晶紫染色再次確定各孔的細胞病變情況，最后根據Reed-Muench法計算病毒的TCID50；

c、藥物對細胞毒性的測定：采用含2％血清的DMEM維持液稀釋成終濃度再給藥，將生長良好的MDCK細胞經胰酶消化成單個細胞后，用生長液調整至2×105/mL，按0.1mL/孔加入96孔微量細胞培養板中，過夜后，加入不同稀釋度的各種藥物，每稀釋度4個復孔，每孔0.2mL，同時設置正常細胞對照孔，37℃5％CO2溫箱培養，每日觀察細胞病變，72小時后采用甲醛固定細胞，利用結晶紫染色法測定細胞病變，以不出現細胞病變CPE的藥物最小稀釋度為藥物的最大無毒濃度TC0，按Reed-Muench法計算50％細胞毒性濃度；

d、體外抗流感病毒藥效測定：將孵育培養12h的MDCK細胞棄去上清液后，每孔吸附感染含不同TCID50的流感病毒稀釋液50μl，置35℃5％CO2培養箱中吸附感染1小時后，加入含藥的細胞維持液，每個濃度4個重復，同時設正常細胞對照和病毒對照，置37℃5％CO2培養箱中培養72h，每日倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，同時采用血凝試驗檢測每孔的病毒滴度，最后采用結晶紫染色法判定各孔的細胞病變程度,最后按Reed-Muench計算50％抑制病毒復制的濃度IC50和治療指數SI，SI＝TC50/IC50；

e、復方銀花解毒藥物對H1N1所致病毒性肺炎的保護作用測定：將動物隨機分組編號，分別分為正常動物組、病毒感染組、利巴韋林組、復方銀花解毒藥物高、低劑量組，各藥物處理組于感染后開始給藥，病毒對照組給藥同體積滅菌水，陽性藥物組采用腹腔注射給藥，每日1次，連續給藥6天，攻毒時除正常對照組用生理鹽水滴鼻外，其余各組經滴鼻感染10LD50的H1N1流感病毒，試驗期間每天觀察動物發病情況，記錄死亡數，共觀察15d，計算死亡保護率和生命延長率。