[發明專利]一種抗腫瘤的多肽組合物及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202010522900.8
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111621440B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 鄭蘭紅;徐一新;王震
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K4/04;C07K1/14;C07K1/18;C07K1/20;A61K38/03;A61P35/00;C12R1/13
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 周瓊

1.一種抗腫瘤多肽組合物的制備方法，所述多肽組合物系從保藏號為CGMCC NO.18765的短桿菌（Brevibacterium sp.）MTL5-77菌株的胞內代謝產物分離獲得，所述多肽組合物所含多肽的分子量為616~1299 Da，所述制備方法包括如下步驟：

（1）發酵培養

將短桿菌Brevibacterium sp. MTL5-77的菌株接種于20~40 mL的培養基，于10~20℃、150~220 r/min的恒溫振蕩培養箱里培養18~28 h，得種子發酵液；

將種子發酵液按照4~10%的接種量接種到40~100 mL培養基中，于相同條件下繼續培養20~28h，得擴增發酵液；

將擴增發酵液按照4~10%的接種量接種到400~600 mL培養基中，于相同條件下繼續培養 36~72h，得發酵菌液；

所述培養基為：3~8 g 蛋白胨，0.5~1.5 g 酵母粉，0.005~0.015 g 磷酸鐵，海水定容至 1 L，在1.05 kg/cm2，115~121 ℃，15~30 min的條件下滅菌；

（2）離心收集菌體

收集上述菌株MTL5-77的發酵菌液，在8000~10000 r/min，4~10 ℃，15~30 min條件下離心，收集菌體；

（3）乙醇浸提

按10~30 mM，pH 7.0~9.5 的Tris-HCl緩沖液:菌體=1:1~1:3 v/v 的比例將Tris-HCl緩沖液加入菌體中，攪拌均勻，使菌體重新溶解，后經終濃度65~80%的乙醇，浸提菌體3~8h，以提取活性粗提物；過濾菌體，收集液體后，于35~50 ℃、80~120 rpm、44 mbar旋蒸至干燥，室溫放置，揮發乙醇，得到菌株MTL5-77的乙醇浸提物；

（4）DEAE陰離子交換色譜分離純化乙醇浸提物

按乙醇浸提物: 10~30 mM，pH 7.0-9.5的Tris-HCl緩沖液=3:1~1:1 mg/mL 的比例將乙醇浸提物加入Tris-HCl緩沖液中，在8,000~12,000 rpm、3~8 ℃條件下，離心15~30 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜，用DEAE柱分離純化乙醇浸提物，得活性組分A；

（5）RP-HPLC高效液相色譜分離純化活性組分A

按活性組分A:水=3:1~1:1 mg/mL 的比例將活性組分A加入水中，在8,000~12,000rpm、3~8 ℃條件下，離心15~30 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜，利用高效液相色譜儀進一步純化，得活性組分B；

（6）XBP C18柱的二次純化活性組分B

按照步驟（5）的方法將活性組分B再次過XBP C18柱，進行分離純化，收集峰型保留時間為5.090 min的流動相組分，得活性組分C；

（7）真空冷凍干燥

將活性組分C真空冷凍干燥，得抗腫瘤多肽組合物BMTP；

所述步驟（4）中用DEAE柱分離純化乙醇浸提物的色譜條件為：色譜柱為DEAE 陰離子交換色譜柱；流速：1.5~10 mL/min；進樣體積：1.5~10 mL；紫外檢測波長：254 nm；進樣緩沖液：10~30 mM，pH 7.0~9.5 的Tris-HCl緩沖液；洗脫緩沖液：將NaCl加入進樣緩沖液中，使NaCl的終濃度為1M；

用DEAE柱分離純化乙醇浸提物的分離方法為：AKTA快速蛋白純化儀用進樣緩沖液沖洗，并平衡DEAE陰離子交換色譜柱；設置流速為1.5~10mL/min，平衡基線；取1.5~10mL過濾0.22 μm濾膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白純化儀；用進樣緩沖液沖洗未能掛柱的組分，再用20~40%的洗脫緩沖液，洗脫掛柱的組分，直接收集如附圖3所示的DEAE陰離子交換層析圖譜中洗脫峰b對應的組分，得活性組分A；

所述步驟（5）中RP-HPLC色譜法的色譜條件為：色譜柱：XBP C18；溫度：4~25 ℃；流速：0.4~0.8 mL/min；進樣量：5~50 μL；紫外檢測波長：254 nm；流動相Ⅰ：乙腈；流動相Ⅱ：純凈水；

RP-HPLC色譜法的分離純化方法為：對高效液相色譜儀進行清洗、脫氣，洗凈XBP C18柱；首先用10%的流動相Ⅰ和90%的流動相Ⅱ沖洗，平衡基線；進樣體積20 μL，流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長λ=254 nm，進行梯度洗脫，收集紫外吸收峰對應的流動相組分；再經過XBP C18柱分離純化后，收集峰型保留時間為5.010 min的流動相組分，得活性組分B；

所述RP-HPLC色譜流動相梯度洗脫的程序為：

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