[發明專利]抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法、構建和應用

有效

• 申請號: 202010522228.2
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111635866B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 嵇豪;金立波;孫達;彭仁義;林蘇娥;董夏夢
• 申請（專利權）人: 溫州大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/38;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 杭州萬合知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 33294
• 代理人: 余冬

本發明公開了一種抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法、構建和應用，通過添加精氨酸可以顯著促進庫德畢赤酵母在極端酸性條件下的生長，緩解細胞聚集，利于氧和營養物質的傳遞，提高了菌株在低pH發酵時的生產性能。本發明還構建了一種抑制細胞聚集的庫德畢赤酵母，該庫德畢赤酵母為過表達ARGJ的重組菌，胞內精氨酸含量提高了26.3％，在pH2.0的條件下生物量有顯著的提高，細胞聚集效應獲得明顯的緩解，有利于營養物質和氧的傳遞。

技術領域

本發明涉及酵母技術領域，具體涉及一種抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法、構建和應用。

背景技術

發酵法生產有機酸時，隨著產物的積累，有機酸以簡單擴散的方式進入微生物細胞并解離為帶電荷的酸根離子和質子，從而導致胞內pH(pHi)下降，影響蛋白質的構象及胞內酶促反應的進行，還會干擾以質子為推動力的主動跨膜運輸，影響微生物細胞對營養物質的吸收，導致發酵性能的急劇下降。開發依賴于酸耐受宿主的低pH發酵技術，可顯著減少甚至摒棄中和劑的使用，簡化生產工藝，降低染菌風險，節約能耗物耗，從而實現建設資源節約型和環境友好型的生物制造。庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)是食品中常見的一種非傳統酵母，在白酒、泡菜和奶酪等中外傳統發酵食品的風味物質形成上發揮了重要作用。它對高溫、滲透壓、乙醇，尤其是有機酸和低pH等環境壓力具有多重耐受，因此被認為是極具潛力的新型生物技術宿主。近年來，基因工程改造的庫德畢赤酵母在琥珀酸、乳酸、木糖酸以及3-羥基丙酸等有機酸及乙醇的低pH發酵中均有報道。但Pichia kudriavzevii在pH小于2.5的酸性條件下以假菌絲形態生長并相互聚(如圖1所示)，這一現象不利于氧和營養物質的傳遞，嚴重影響了菌株的低pH發酵時的生產性能。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法、構建和應用。本發明可以抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集，提高發酵性能。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下：抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法，添加精氨酸促進庫德畢赤酵母在低pH條件下的生長，緩解細胞聚集。

前述的抑制庫德畢赤酵母菌株細胞聚集的方法，所述庫德畢赤酵母生長YPD培養基包括以下質量濃度的成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母抽提物10g/L，再利用HCl或NaOH調整YPD培養基的pH在2.5以下，高壓蒸汽滅菌后向培養基中添加5mmol/L精氨酸。

一種抑制細胞聚集的庫德畢赤酵母，在德畢赤酵母菌株為Pichia kudriavzeviiN-X中過量表達ARG J基因構建重組菌株；Pichia kudriavzevii N-X保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山，保藏號：CCTCC M 2017759。

上述的抑制細胞聚集的庫德畢赤酵母在低pH發酵中的應用。

前述的抑制細胞聚集的庫德畢赤酵母的構建方法，包括以下步驟：

a、利用引物Pdc1F、Pdc1R以及庫德畢赤酵母N-X基因組DNA為模板擴增獲得含有PDC1基因啟動子，閱讀框和終止子的片段，并連入pMD19T載體；所述引物Pdc1F為CGCGGATCCGCGTTTAAGTGGTGGTTGTA，所述引物Pdc1R為CGG GGTACCTGGT GAGATTGATGGATTGT；

b、利用引物0-F和0-R進行反向擴增；所述引物0-F為ACAGATAAGTACCTAGGGAGATT，所述引物0-R為TGACATCT GAATGTAAAATGAAC；

c、利用引物1-F、1-R和質粒pGAPZB為模板擴增獲得博來霉素抗性基因BLE和CYC1終止子；所述引物1-F為acacagcaaaacacaaaaatATG GCCAAGTTGACCAGTGC；所述引物1-R為tatcgaaatctagcccGCAAATTAAAGCCTTCGA GC；