[發(fā)明專利]一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010522089.3
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111766315A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉軍;晏石娟;高家東;張友勝;黃文潔
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心;廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 廣州藍(lán)晟專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44452
• 代理人: 欒洋洋;丁海燕

1.一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)提取水稻種子中的葡萄糖酸；

(2)定量測定水稻種子中的葡萄糖酸含量，包括絕對含量或相對含量；

(3)利用貯藏前后種子的葡萄糖酸含量比值判別劣變種子；

以貯藏前新種子的葡萄糖酸含量作為該水稻種子的基準(zhǔn)活力指標(biāo)，記為A0；測定需要判別劣變種子的貯藏后水稻種子中的葡萄糖酸含量，記為A；測定自然老化2年后的水稻種子中的葡萄糖酸含量，記為A1；計算出需要判別劣變種子的貯藏后水稻種子中的葡萄糖酸含量A和水稻種子的基準(zhǔn)活力指標(biāo)A0的比值，記為K；計算出自然老化2年后的水稻種子中的葡萄糖酸含量A1和水稻種子的基準(zhǔn)活力指標(biāo)A0的比值，記為K1；根據(jù)K值是否大于等于K1，判別儲藏后水稻種子是否屬于劣變種子，當(dāng)K值≥K1值時，判定儲藏后水稻種子屬于劣變種子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法，其特征在于：步驟(1)所述提取水稻種子中的葡萄糖酸具體按照以下步驟：取水稻種子，或單獨(dú)的水稻種胚或者胚乳，置于液氮預(yù)冷的組織研磨儀中研磨成粉末后，準(zhǔn)確稱取50mg粉末置于2ml Eppendorf離心管中，每個管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水體積比為5:2:2的提取液，再加10μL核糖醇作為內(nèi)標(biāo)；提取時，離心管上下震蕩1min，渦旋5min，再以11000rpm和4℃離心10min，將200μL上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，置于真空濃縮干燥儀中干燥；在干燥后的葡萄糖酸樣品中，加入50μL新配的濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽-吡啶溶液，充分混勻，在37℃，200rpm下反應(yīng)2h；再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，混勻，在37℃，200rpm下?lián)u30min；反應(yīng)結(jié)束后，立即吸取葡萄糖酸衍生化樣品轉(zhuǎn)移到裝有250μL內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣瓶置于自動進(jìn)樣盤內(nèi)，進(jìn)行后續(xù)步驟的GC-MS分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法，其特征在于：步驟(2)所述相對含量的定量測定的方法為：將步驟(1)提取得到的葡萄糖酸進(jìn)行GC-MS分析、對GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理、獲得不同樣品中葡萄糖酸的峰面積信息、將峰面積定量信息做歸一化處理，得到代謝物葡萄糖酸最終的相對含量。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法，其特征在于：所述GC-MS分析的具體條件如下：進(jìn)樣口溫度為270℃；載氣為高純氦氣，純度99.999％，流速1mL/min；分流進(jìn)樣，分流比50:1；升溫程序?yàn)椋?5℃保持5min，以8℃/min速率升至205℃保持5min，以8℃/min速率升至300℃保持5min；進(jìn)樣量1μL；質(zhì)譜的離子源EI，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電子能量70eV，傳輸線溫度280℃，電子倍增器電壓1400V，質(zhì)量掃描范圍為60-1000amu，溶劑延遲為5.00min；

所述對GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理是采用AglientChemstion軟件對GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲得不同樣品中葡萄糖酸的峰面積信息、以同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積為基準(zhǔn)將葡萄糖酸峰面積做歸一化處理，得到代謝物葡萄糖酸最終的相對含量。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葡萄糖酸含量變化比值判別水稻劣變種子的方法，其特征在于：步驟(2)所述絕對含量的定量測定的方法為：將步驟(1)提取得到的葡萄糖酸進(jìn)行GC-MS分析，利用葡萄糖酸標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算種子中葡萄糖酸的絕對含量，其單位為μg/g。