[發(fā)明專利]用于低溫條件保持細(xì)胞活性的保存液及保存方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010521647.4
• 申請(qǐng)日: 2020-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN111513060A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉崇懿;李婷婷;孟憲欣;肖華勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海伯豪生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務(wù)所 31325
• 代理人: 王函

本發(fā)明提供了一類用于低溫條件保持細(xì)胞活性的保存液及保存方法。保存液的成分為優(yōu)化的維持細(xì)胞低溫條件下保持活性的配方組成；保存液pH值為7.2?7.6；保存溫度為0?6℃。成分中不含有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性和造成基因表達(dá)改變的成分，安全環(huán)保。同時(shí)保存方法中無需凍存和復(fù)蘇等過程，細(xì)胞全程處于保持活性狀態(tài)，簡(jiǎn)單易用，方便細(xì)胞的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。本發(fā)明可有效實(shí)現(xiàn)人和動(dòng)物多種類型的細(xì)胞低溫存儲(chǔ)，低溫條件下可保持細(xì)胞的活性，經(jīng)驗(yàn)證可用于人血液細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、組織樣本消化解離細(xì)胞的低溫保存與運(yùn)輸。保存后的細(xì)胞可用于基因檢測(cè)相關(guān)研究或其他細(xì)胞保存等相關(guān)應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于低溫條件下保持人或動(dòng)物細(xì)胞活性的保存液；此外，本發(fā)明還涉及使用該保存液的保存方法。

背景技術(shù)

隨著基因檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究的逐步深入和臨床應(yīng)用的普及，如何安全、有效保存生物樣本成為關(guān)鍵。其中研究最為廣泛的細(xì)胞樣本，例如臨床血液細(xì)胞、組織消化解離的細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞等，從采集到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，存在著時(shí)間和空間的距離，如何保證細(xì)胞樣本在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中維持細(xì)胞活性及基因表達(dá)的穩(wěn)定，將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確有效。尤其是目前基因檢測(cè)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及ATAC-seq（一種研究染色質(zhì)可及性的分子生物學(xué)方法）等，對(duì)于細(xì)胞樣本的保存有著更高的要求，例如要求細(xì)胞活性一般不低于80 %，從而避免細(xì)胞死亡后造成的核酸降解、基因信息的丟失。同時(shí)基于細(xì)胞的相關(guān)臨床治療和基礎(chǔ)研究，例如CAR-T（嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法）、干細(xì)胞等，都對(duì)于細(xì)胞的保存和運(yùn)輸提出了巨大的需求。

目前細(xì)胞樣本一般采用超低溫凍存的方式，細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基、二甲亞砜和血清等成分組成的凍存液中，經(jīng)過梯度降溫后，保存在-80℃或液氮中。這些步驟操作復(fù)雜，極易造成細(xì)胞的死亡。對(duì)于基因相關(guān)檢測(cè)和研究的細(xì)胞樣本，這一凍存的過程易造成基因信息的丟失及細(xì)胞種群的缺失。而對(duì)于干細(xì)胞等，凍存液中的成分及凍存復(fù)蘇過程易造成干細(xì)胞的分化。細(xì)胞樣本的儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中難以長期保持凍存的溫度或細(xì)胞正常生長的適宜溫度（37℃）。而在37℃條件是并且此時(shí)細(xì)胞處于增殖生長狀態(tài)，一方面需要大量的培養(yǎng)基維持生存，另一方面基因的表達(dá)也存在改變的風(fēng)險(xiǎn)，例如造成干細(xì)胞的分化。在低溫條件下，例如0-4℃，此時(shí)細(xì)胞的新陳代謝明顯下降，不再增殖，接近凍存是細(xì)胞的狀態(tài)。然而低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)外溶液易產(chǎn)生冰晶，從而對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。因此需要將細(xì)胞保存在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐锌梢赃_(dá)到保持細(xì)胞活性，保持基因表達(dá)穩(wěn)定的效果。例如器官移植使用的保存液，可保持器官的活性和移植后的生理功能。但目前器官移植使用的保存液等對(duì)于細(xì)胞的保存并不適用。一方面器官保存液中包含激素成分，例如地塞米松、胰島素、前列腺素等會(huì)對(duì)保存的細(xì)胞產(chǎn)生刺激，從而對(duì)細(xì)胞基因水平上的產(chǎn)生影響，造成基因表達(dá)的改變，影響下游基因檢測(cè)和研究，或影響干細(xì)胞的分化。另一方面由于細(xì)胞樣本與器官存在著胞外滲透壓、離子通透性和細(xì)胞種類的差異。因此亟待針對(duì)性的設(shè)計(jì)、開發(fā)用于細(xì)胞樣本的保存試劑，在低溫條件（0-4℃）下保持細(xì)胞的存活率，并且不改變細(xì)胞的基因表達(dá)，解決細(xì)胞樣本的保存與運(yùn)輸。

目前大部分用于細(xì)胞的保存與運(yùn)輸過程都是采用超低溫凍存的方式，-80℃超低溫凍存和液氮的凍存方式。不易于樣本的采集和運(yùn)輸。同時(shí)凍存和復(fù)蘇過程，易造成細(xì)胞的死亡和對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)造成影響。

中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN107183012A公開了一種人體干細(xì)胞的冷凍液及冷凍存儲(chǔ)方法，是采用超低溫冷凍（-80℃）和液氮的保存方式。而對(duì)于凍存的保存方式，文獻(xiàn)報(bào)道了超低溫凍存的樣本用于單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)檢測(cè)會(huì)造成轉(zhuǎn)錄組的完整性和細(xì)胞群類異質(zhì)性的降低。而復(fù)蘇的操作容易造成組織細(xì)胞的死亡，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。且該專利申請(qǐng)人體干細(xì)胞的冷凍液中的必要成分DMSO在非冷凍條件下（例如，0-6℃下）會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN201811329711.8公開了一種細(xì)胞保存液及使用細(xì)胞保存液保存細(xì)胞的方法。保存液成分中包含甲醇成分，雖然可以對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行固定，但此時(shí)細(xì)胞處于死亡狀態(tài)，不能保持細(xì)胞的活性，易造成核酸的降解。同時(shí)死亡后的細(xì)胞在保存液中處于細(xì)胞膜通透狀態(tài)，會(huì)造成胞內(nèi)核酸游離到體系外，引起基因信息的丟失。無法應(yīng)用到單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)等。