[發明專利]一種通過檢測RNA降解程度判斷法醫學中血痕形成時間的方法

有效

• 申請號: 202010517271.X
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111850106B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 趙東;劉錦媛
• 申請（專利權）人: 中國政法大學
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.特異性引物組合在檢測人血痕中RNA降解程度、判斷法醫學中血痕形成時間中的應用，所述的引物組合由一對短引物、一對中引物以及一對長引物組成，其中，所述的一對短引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一對中引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；所述的一對長引物的核苷酸的序列如SEQ IDNO.5以及SEQ ID NO.6所示。

2.一種通過檢測RNA降解程度判斷法醫學中血痕形成時間的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)從人血痕樣本中提取RNA；

(b)RNA反轉錄得到人血痕樣本cDNA；

(c)以人DNA為模板，使用一對短引物、一對中引物以及一對長引物分別進行PCR擴增，得到的產物分別連接到同一載體，構建標準品質粒用于實時熒光定量PCR擴增，以標準品質粒Ct值為縱坐標，起始拷貝數的對數為橫坐標，制作對應的標準曲線；

所述的一對短引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一對中引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；所述的一對長引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示；

(d)以反轉錄得到的人血痕樣本cDNA為模板，使用所述的一對短引物、一對中引物以及一對長引物分別進行實時熒光定量PCR擴增，分別得到各自的Ct值，根據標準曲線計算擴增產物的起始拷貝數，進而得到RNA完整度：

RNA完整度＝中片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數；以及

RNA完整度＝長片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數；

(e)判定

根據RNA完整度判定人血痕中RNA的降解程度，即長片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數的值與中片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數的值越小，則表示RNA完整度越差，RNA降解程度越嚴重，人血痕樣本形成的天數越長。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(e)中人血痕樣本形成天數與長片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數擬合的數學方程為y＝-0.0002x+0.0217，其中y表示長片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數的值，x表示血痕形成天數，長片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數的值越小，則RNA完整度越差，RNA降解程度越嚴重，人血痕樣本形成的天數越長；

人血痕形成時間與中片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數擬合的數學方程為y＝-0.0018x+0.4198，其中y表示中片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數，x表示存放天數，中片段目的序列起始拷貝數/短片段目的序列起始拷貝數越小，則RNA完整度越差，RNA降解程度越嚴重，人血痕樣本形成的天數越長。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(b)中反轉錄的反應體系如下所示：

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(b)中反轉錄的反應條件如下所示：

42℃孵育30分鐘，85℃加熱5分鐘，置于4℃條件下保存。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(c)以及步驟(d)中實時熒光定量PCR擴增的擴增體系如下所示：

擴增體系中引物終濃度為200nM。

7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(c)以及步驟(d)中實時熒光定量PCR擴增的反應條件如下：

預變性：95℃，3分鐘；變性：95℃，10秒；退火/延伸/數據采集62℃，32秒；共40個循環。