[發(fā)明專利]一種基于全基因組重測(cè)序的甘藍(lán)型油菜蠟粉基因定位方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010517170.2
• 申請(qǐng)日: 2020-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN111575399B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張俊英;朱吉風(fēng);周熙榮;楊立勇;江建霞;蔣美艷;李延莉;王偉榮;孫超才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;A01H1/02;A01H1/04;G16B30/10;G16B50/30
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

1.一種基于全基因組重測(cè)序的甘藍(lán)型油菜蠟粉基因定位方法，包括以下步驟：

1)以甘藍(lán)型油菜純合兩型系D0721的不育株為母體，臨保系D1577為父本，進(jìn)行雜交，得到F1代全不育系；

2)將F1代全不育系和無蠟粉性狀的恢復(fù)系D0936進(jìn)行雜交，得到F2代；

3)在F2～F6代的15：1分離群體中選擇有蠟粉性狀的植株自交；

4)在所述F6代的3：1分離群體中選擇無蠟粉性狀的植株作為第一子代備選植株，在所述F6代的全部有蠟粉表型不分離群體作為第二子代備選植株，將D0721作為第一親本備選植株，D1577作為第二親本備選植株，D0936作為第三親本備選植株，得到五組備選植株；

5)分別提取所述五組備選植株的基因組DNA，利用提取到的基因組DNA分別構(gòu)建文庫，對(duì)各個(gè)文庫進(jìn)行30×覆蓋度的全基因組重測(cè)序，得到五組測(cè)序數(shù)據(jù)，分別為第一子代測(cè)序數(shù)據(jù)、第二子代測(cè)序數(shù)據(jù)、第一親本測(cè)序數(shù)據(jù)、第二親本測(cè)序數(shù)據(jù)和第三親本測(cè)序數(shù)據(jù)；

6)利用Trimmomatic對(duì)所述五組測(cè)序數(shù)據(jù)分別進(jìn)行質(zhì)量控制，選擇Pherd分值大于Q20的序列樣本，得到五組待分析數(shù)據(jù)，分別為第一子代待分析數(shù)據(jù)、第二子代待分析數(shù)據(jù)、第一親本待分析數(shù)據(jù)、第二親本待分析數(shù)據(jù)和第三親本待分析數(shù)據(jù)；

7)將所述五組待分析數(shù)據(jù)分別與甘藍(lán)型油菜參考基因進(jìn)行比對(duì)，去除PCR重復(fù)，注釋SNP和InDel，完成基因分型；

8)基于所述基因分型的結(jié)果，以第一親本待分析數(shù)據(jù)、第二親本待分析數(shù)據(jù)和第三親本待分析數(shù)據(jù)作為參照，分別計(jì)算第一子代待分析數(shù)據(jù)和第二子代待分析數(shù)據(jù)在每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上的SNP-index，統(tǒng)計(jì)平均值，得到兩組SNP-index，分別為第一SNP-index和第二SNP-index；

9)取第一SNP-index和第二SNP-index差值的絕對(duì)值，繪制SNP-index圖；選取95％和99％的置信水平作為篩選的閾值，超過閾值外的區(qū)域作為候選區(qū)域；

10)對(duì)所述候選區(qū)域內(nèi)SNP的堿基與參考基因相應(yīng)位置的堿基進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)第一親本待分析數(shù)據(jù)、第二親本待分析數(shù)據(jù)、第三親本待分析數(shù)據(jù)、第一子代待分析數(shù)據(jù)和第二子代待分析數(shù)據(jù)中的堿基突變類型，篩選出親本和與之近似的混池材料中堿基突變類型相一致的候選基因，作為候選基因；

11)利用Non-Redundant Protein Sequence、Gene Ontology和Kyoto EncyclopediaofGenes and Genomes數(shù)據(jù)庫注釋對(duì)所述候選基因進(jìn)行初步篩選，得到目的基因；采用BRAD數(shù)據(jù)庫和TAIR數(shù)據(jù)庫對(duì)所述目的基因進(jìn)行同源性分析和功能預(yù)測(cè)；

步驟1)中所述甘藍(lán)型油菜純合兩型系D0721的保藏編號(hào)為：CCTCC NO：P202001；所述臨保系D1577的保藏編號(hào)為CCTCC NO：P202002

步驟2)中所述恢復(fù)系D0936的保藏編號(hào)為CCTCC NO：P202003。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述第一子代備選植株和第二子代備選植株的數(shù)量分別為40～60株；所述第一親本備選植株、第二親本備選植株和第三親本備選植株的數(shù)量分別為15～25株。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟5)分別提取所述五組備選植株的基因組DNA后，還包括將提取到的五組備選植株的基因組DNA隨機(jī)打斷成350bp的片段，基于打斷后的基因組DNA片段，采用TruSeq DNALT Sample Prep kit試劑盒分別構(gòu)建文庫。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8)中所述SNP-index根據(jù)reads測(cè)序深度信息計(jì)算，利用測(cè)序reads對(duì)每個(gè)堿基位點(diǎn)的堿基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算與作為參照的基因組不相同的reads條數(shù)占總條數(shù)的比例，得到堿基位點(diǎn)的SNP-index。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟8)所述統(tǒng)計(jì)平均值的過程中定位時(shí)以1Mb為窗口，以10Kb為步移。