[發明專利]一種提高植物PAL酶活性與苯丙烷合成通路活性的方法

有效

• 申請號: 202010515709.0
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111893132B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 趙婷婷;許向陽;吳泰茹;王子玉;裴童;楊歡歡;姜景彬;張賀;李景富;陳秀玲;王傲雪
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

一種提高植物PAL酶活性與苯丙烷合成通路活性的方法，屬于植物基因工程技術領域。為了研究苯丙烷途徑及其調控機制，本發明將SEQ ID No.1所示的基因序列構建到植物超表達載體中，然后導入農桿菌中，通過農桿菌侵染法轉化植物，經培養后獲得轉基因材料。研究發現SEQ ID No.1所示基因的超表達不改變番茄植株本身的表型及主要生理指標性狀，但是可以使番茄葉片中的PAL活性提高，且導致苯丙烷合成通路發生顯著性富集，通路中多個調控點相關基因發生上調表達，通路活性得到增強。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種提高植物PAL酶活性與苯丙烷合成通路活性的方法。

背景技術

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)廣泛存在于綠色植物、藻類、真菌和細菌中的寡聚體酶蛋白，由4個亞基構成。它是催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶,是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶,也是苯丙烷類代謝途徑中研究最多的酶。苯丙氨酸經PAL脫氨生成肉桂酸，再進一步轉化為對香豆酸。最后，在4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的催化下，將對香豆酸轉化為對香豆酸輔酶A，這是生成各種苯丙類化合物的途徑中的一個重要的代謝點。隨后在其他酶的作用下進一步將產物轉化為細胞壁次生壁的重要組成成分木質素，以及黃酮類和酚類等產物。PAL酶像調控通路匯合和分流的開關一樣，控制苯丙氨酸的催化進入下游不同的分支途徑。

苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑，苯丙類化合物通常由一個六碳芳香族苯基和一個三碳丙烷側鏈組成。根據苯環上丙烯基雙鍵和取代基的位置，可以將苯丙酯分為不同的生物活性基團。此類化合物結構豐富且功能多樣，部分芳香化合物還具有很高的經濟價值。目前，在植物中已經分離到幾千種苯丙烷類代謝物，根據其結構特點可以分成不同的類別，主要包括黃酮、黃酮醇、香豆素、花青素、花色素苷、肉桂酸及大分子化合物木質素等。這些化合物以單體或者復合物的形式存在于植物特定的組織器官和發育階段中，不僅在植物的形態構成、生長發育中起重要作用，還參與植物應答多種逆境脅迫的信號傳導過程。如作為細胞次生壁主要成分的木質素，給細胞提供機械支持力并維持水分和養分的運輸。許多可溶性的酚類物質不但可以作為花色物質吸引傳粉者，還能保護植物免受紫外線、活性氧的氧化損傷，同時還是重要的生物活性成分，具有重要的藥理功效，如綠原酸。黃酮類和花青素類物質可以作為抗病毒劑、抗氧化劑直接保護植物免受生物和非生物脅迫，或者作為介導植物－微生物相互作用的信號分子。總之，這些酚類化合物作為典型的次生代謝物，不僅賦予植物特殊的顏色和味道，還使植物能夠適應外界不斷變化的環境和各種脅迫。因此，植物萜類代謝途徑特別是苯丙烷途徑及其調控機制的研究具有重要的理論意義和實際應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種提高植物PAL酶活性與苯丙烷合成通路活性的方法，將SEQ ID No.1所示的基因序列構建到植物超表達載體中，然后導入農桿菌中，通過農桿菌侵染法轉化植物，經培養后獲得轉基因材料。

在本發明的一個實施例中，所述植物為番茄。

在本發明的一個實施例中，所述提高植物PAL酶活性與苯丙烷合成通路活性的轉基因方法如下：

1)提取番茄RNA，經反轉錄后獲得cDNA；

2)以序列號為Solyc05g056120.2.1的CDS區設計引物，以步驟1)得到的cDNA為模板進行PCR擴增得到Solyc05g056120.2.1序列的CDS區；

3)將步驟2)得到的CDS區序列插入到pCAM2300載體中，得到植物重組表達載體；

4)然后轉化農桿菌，通過農桿菌侵染法轉化番茄得到轉基因番茄。

在本發明的一個實施例中，步驟1)所述的番茄為Micro-TOM。

在本發明的一個實施例中，步驟2)所述引物為：