[發(fā)明專(zhuān)利]一種雙向鏈替換環(huán)循環(huán)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010515612.X
• 申請(qǐng)日: 2020-06-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111662962B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江洪;曲越;曲超琪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 珠海市坤元科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6848
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6848
• 代理公司: 珠海智專(zhuān)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44262
• 代理人: 林永協(xié)

“一種雙向鏈替換環(huán)循環(huán)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增法”，屬于核酸恒溫?cái)U(kuò)增領(lǐng)域，其特征是一種環(huán)介導(dǎo)的鏈替換聚合酶擴(kuò)增，采用一對(duì)模板引物5'前端預(yù)加對(duì)側(cè)引物或稍短序列形成嵌合引物對(duì)，其新合成延伸鏈被模板外替換引物延伸替換出模板復(fù)制單鏈，新生單鏈預(yù)加首端與自身互補(bǔ)區(qū)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，再用嵌合引物間的內(nèi)替換引物結(jié)合環(huán)延伸后替換出莖環(huán)的嵌合引物區(qū)而露出兩個(gè)及以上多引物結(jié)合位點(diǎn)，多個(gè)嵌合引物結(jié)合延伸鏈被5'外側(cè)引物延伸后替換出成倍單鏈而形成子代莖環(huán)，內(nèi)外雙向鏈替換以及較短的莖環(huán)鏈替換高效率促使環(huán)循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)濁度、染料、熒光檢測(cè)，核酸結(jié)合熒光于65℃及以上讀值、染料白光及紫外顯色。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及核酸PCR恒溫?cái)U(kuò)增的快速檢測(cè)領(lǐng)域，具體地是利用DNA莖環(huán)可恒溫結(jié)合引物復(fù)制、鏈替換循環(huán)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

多聚酶鏈反應(yīng)PCR是在1953年Watson建立的DNA雙螺旋模型及半保留復(fù)制法則基礎(chǔ)以及1971年Khorana體外擴(kuò)增思想上，于體外(試管內(nèi))模擬自然基因復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)；直至1985年，美國(guó)Cetus公司Mullis想到了PCR本質(zhì)-指數(shù)擴(kuò)增或幾何級(jí)數(shù)式放大的巨大威力,發(fā)明了一對(duì)特異引物結(jié)合、復(fù)制靶分子基因，模擬天然DNA半保留復(fù)制的熱循環(huán)PCR技術(shù)，再經(jīng)過(guò)一系列發(fā)展和耐熱聚合酶、熱循環(huán)儀的發(fā)明、應(yīng)用，Cetus公司1987年申請(qǐng)了首個(gè)PCR發(fā)明專(zhuān)利(US?Patent?4,683,202)。

隨即PCR以幾何級(jí)數(shù)放大的超級(jí)靈敏度和操作簡(jiǎn)便性成為生命科學(xué)最基礎(chǔ)技術(shù)，其各種發(fā)展和應(yīng)用一直是最熱門(mén)中心，根據(jù)PCR指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)中DNA解鏈方式不同，可以將核酸擴(kuò)增技術(shù)分為常規(guī)熱循環(huán)PCR擴(kuò)增和核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩大類(lèi)。熱循環(huán)擴(kuò)增包括普通終末PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，循環(huán)擴(kuò)增經(jīng)一步變性：靶DNA雙鏈經(jīng)高溫94℃變性—解鏈為單鏈，二步退火：降溫至54℃左右復(fù)性使過(guò)量引物粘合至單鏈互補(bǔ)區(qū)并以dNTP為聚合酶底物原料，互補(bǔ)序列為模板，引物末端開(kāi)始滲入底物、復(fù)制，三步延伸：升溫至72℃左右，在耐熱DNA聚合酶的作用下，以結(jié)合引物自身延伸成為一條與模板互補(bǔ)新鏈，子代一半新鏈一半母鏈半保留復(fù)制。不斷重復(fù)變性--退火--延伸步驟循環(huán)，這種新鏈、母鏈又可成為下次循環(huán)的模板，靶分子以2ⁿ級(jí)數(shù)擴(kuò)增過(guò)億倍的復(fù)制DNA供檢測(cè)。多聚酶鏈反應(yīng)PCR尤其實(shí)時(shí)熒光定量PCR已成為重大疾病核酸檢測(cè)的首選并且難以替代的重要技術(shù)，但熱循環(huán)所需復(fù)雜設(shè)備及較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間和熱循環(huán)帶來(lái)的引物聚合非特異性都限制了其使用優(yōu)越性。

目前核酸PCR擴(kuò)增檢測(cè)需要專(zhuān)們物理隔離的分子檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室和專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)訓(xùn)練人員操作，大量疾病流行及基層地區(qū)亟需不依賴(lài)熒光熱循環(huán)儀器的核酸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或大規(guī)模檢測(cè)，和家庭診所及醫(yī)院床邊(POCT)適合快速便捷的核酸恒溫檢測(cè)技術(shù)方法。早期的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有鏈替換擴(kuò)增(SDA)，依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，Qβ復(fù)制酶(Q-beta?replicase)催化RNA擴(kuò)增,滾環(huán)擴(kuò)增(RCA),和較近期的解鏈酶擴(kuò)增技術(shù)等。但這些初期恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成熟度和使用率遠(yuǎn)不及熱循環(huán)PCR擴(kuò)增效果。使用較多和本專(zhuān)利相近的有環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增LAMP(Nucleic?Acids?Res.2000,Vol.28,No.12,e63)，利用引物5'端帶有的模板中倒置序列促使新合成的單鏈3'互補(bǔ)末端能返折自身結(jié)合而鏈內(nèi)延伸擴(kuò)增；交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增CPA(中國(guó)專(zhuān)利ZL200810134583.1)，利用引物5'端帶有對(duì)側(cè)引物序列促使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有更多的引物結(jié)合位點(diǎn)而使一引物下游的引物產(chǎn)物鏈替換循環(huán)且新生片段聚合越來(lái)越長(zhǎng)。但環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增LAMP反應(yīng)流程復(fù)雜而結(jié)果預(yù)期不明確，聚合酶的鏈替換功能對(duì)于連續(xù)超長(zhǎng)菜花樣產(chǎn)物片段鏈替換效率低下致使靈敏度仍不足和低濃度模板反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于1小時(shí)；交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增CPA開(kāi)始反應(yīng)時(shí)只是產(chǎn)物逐個(gè)引物延長(zhǎng)、增量線(xiàn)性上升(相對(duì)指數(shù)放大線(xiàn)性增量太少)，擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)中成倍產(chǎn)物鏈產(chǎn)生數(shù)量不夠、效率不高而反應(yīng)不恒定，CPA反應(yīng)后期出現(xiàn)長(zhǎng)產(chǎn)物，其每端有3個(gè)(3對(duì))及以上的引物結(jié)合位點(diǎn)才開(kāi)始指數(shù)鏈替換反應(yīng)，結(jié)果CPA靈敏度仍顯不足和低濃度樣本反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于1小時(shí)。