[發明專利]一種去除大腸桿菌重組表達豬細小病毒VP2蛋白中內毒素的方法有效
| 申請號： | 202010515345.6 | 申請日： | 2020-06-09 |
| 公開（公告）號： | CN111606978B | 公開（公告）日： | 2023-03-17 |
| 發明（設計）人： | 劉運超;張改平;王聚財;陳玉梅;尚延麗;王方雨;魏薔;馮華;楊蘇珍;柴書軍;金前躍;鄧瑞廣 | 申請（專利權）人： | 河南省農業科學院;河南中澤生物工程有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/015 | 分類號： | C07K14/015;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C07K1/14;C12P21/02;A61K39/23;A61P31/20;C12R1/19 |
| 代理公司： | 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122 | 代理人： | 張愛軍 |
| 地址： | 450002 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 去除 大腸桿菌 重組 表達 細小 病毒 vp2 蛋白 內毒素 方法 | ||
1.一種去除大腸桿菌重組表達豬細小病毒VP2蛋白中內毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液的制備：采用大腸桿菌表達系統重組表達豬細小病毒VP2蛋白，經高速離心、硫酸銨沉淀，收集得豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液；
（2）氫氧化鋁懸液的制備：將氫氧化鈉和氯化鋁混合，pH為6.0~6.8，在2~8℃條件下反應，得到20g/L的氫氧化鋁懸液；
（3）氫氧化鋁吸附：對步驟（1）所得的豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液進行預處理，隨后緩慢加入步驟（2）所得的氫氧化鋁懸液進行吸附，邊加入邊攪拌，溫度為2~8℃，轉速為100rpm，攪拌時間為1～3h，攪拌完成后，離心處理得去除內毒素后的蛋白溶液上清液；
重復氫氧化鋁懸液吸附1次；其中每次氫氧化鋁懸液的加入量均按Al2O3的濃度計算，當Al2O3在VP2蛋白抗原溶液中的濃度為0.1mg/mL時，停止加入氫氧化鋁懸液；
（4）層析法分離：采用吸附層析法，將步驟（3）所得的去除內毒素后的蛋白溶液上清液進行預處理，隨后以一定的流速上樣到層析介質，上樣前先用清洗液清洗層析柱，然后用平衡緩沖液平衡層析柱，上樣時收集上樣流穿溶液，上樣完成后用2倍柱體積的平衡緩沖液沖洗層析柱，收集層析柱流出液，合并流穿溶液與層析柱流出液，得到去除內毒素的豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液；
所述吸附層析法所用填料為復合模式層析介質Capto? Core700；所用清洗液為含有30% 體積含量異丙醇的1mol/L NaOH；所用平衡緩沖液pH為8.0、含200 mM氯化鈉的10 mMPB緩沖液；流速為1/10~1/20柱體積每分鐘。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中大腸桿菌表達系統重組表達豬細小病毒VP2蛋白的方法為：構建豬細小病毒VP2蛋白重組表達菌株，將活化后的豬細小病毒VP2重組菌株接種于LB培養基，在溫度37℃、轉速220rpm搖床培養3~5h，待菌株培養液的吸光值OD600達到0.8~1.2，加入終濃度為0.1~0.15 mM IPTG誘導重組表達的豬細小病毒VP2蛋白，在溫度25℃、轉速220rpm搖床中繼續培養12~16h。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中豬細小病毒VP2蛋白抗原溶液的收集方法具體為：
a、以8000 rpm的轉速離心處理經大腸桿菌表達系統重組表達的豬細小病毒VP2蛋白溶液，收集離心后沉淀，即得到重組表達VP2蛋白大腸桿菌菌體，稱量菌體濕重，加入pH值為6.3的10 mM PB緩沖液重懸菌體，其中菌體濕重的質量與PB緩沖液的體積比為1:20；
b、將步驟a經PB緩沖液重懸后的大腸桿菌菌體，先用超聲破碎或高壓均質機破碎，再以8000rpm的轉速離心處理破碎的菌體，收集離心后上清，去除破碎菌體碎片，即得到破碎菌體上清溶液；
c、向步驟b收集的破碎菌體上清溶液中加入硫酸銨，邊加入邊攪拌，形成40%飽和度的硫酸銨溶液，以100 rpm的轉速持續攪拌2h后，再以8000 rpm的轉速，2~8℃條件下離心30min，收集離心后沉淀；
d、向步驟c收集的沉淀中加入10 mM PBS緩沖液使沉淀溶解，加入的PBS緩沖液體積與步驟(a)中的PB緩沖液的體積相同，即得豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，其中超聲破碎的條件為：工作3s、間歇5s、功率60w、時間15min，將重懸的菌液置于冰水混合浴中，探頭插入液面以下1.0~2.0cm，開始超聲破碎；
高壓均質機破碎的條件為：壓力800bar，溫度控制在5~10℃，進樣速度為480mL/min，高壓破碎1遍。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中豬細小病毒重組VP2蛋白抗原溶液預處理的方法為：加入10 mM PB緩沖液，調整pH為6.0~6.8，溫度為2~8℃；所述離心處理的離心力為7000g~9000g，離心溫度為4-8℃，離心時間為20~40min。
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