[發明專利]一種檢測人NRAS基因突變的PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202010515171.3
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN112126681A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 陸軍
• 申請（專利權）人: 上海佰臻生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種檢測人NRAS基因突變的PCR試劑盒，試劑盒包括核酸擴增試劑和對照品，其中，核酸擴增試劑包括NRAS Q61H反應液、NRAS Q61K反應液、NRAS Q61L反應液、NRAS Q61R反應液，反應液中分別含有用于檢測NRAS Q61H、Q61K、Q61L、Q61R突變的特異性引物和探針，每個反應液中包含一對上游引物和下游引物，以及TaqMan熒光探針。本試劑盒采用ARMS?PCR的方法，分別設計了針對Q61H、Q61K、Q61L、Q61R位點特異性的引物和探針；本試劑盒可以對結直腸癌、甲狀腺癌及黑色素瘤患者腫瘤組織DNA樣本NRAS基因的Q61H、Q61K、Q61L、Q61R位點突變進行檢測；本試劑盒能檢測出50ng DNA總量中低至0.1%水平的突變。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，特別涉及一種檢測人NRAS基因突變的PCR試劑盒。

背景技術

NRAS基因是人類最重要的原癌基因之一，位于人染色體1p13.2，由7個外顯子組成，編碼蛋白約21kDa。NRAS突變主要位于3號外顯子第61號氨基酸編碼子，該突變會影響RAS介導的GTP水解作用，并會導致NRAS蛋白持續保持活化狀態，不再依賴上級信號的刺激，處于與GTP持續結合的狀態，導致下游的信號通路異常活躍，從而促進細胞的生長與增殖，細胞增殖失控而癌變。

直腸結腸癌(colorectalcancer，CRC)是常見的惡性腫瘤。研究表明，CRC發生與多種基因突變密切相關，其中包括KRAS、BRAF、NRAS。以上基因均參與細胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等過程的調節。一些研究表明NRAS突變與EGFR單克隆抗體(西妥昔單抗和帕尼單抗)治療的耐藥相關，NCCN結腸癌和直腸癌指南不推薦NRAS2、3、4號外顯子突變的結直腸癌患者使用西妥昔單抗和帕尼單抗等治療，NRAS突變往往提示不良預后，所以，部分學者考慮將NRAS作為腫瘤分子標志物對CRC預后進行分級評估。

根據組織發生和形態結構甲狀腺癌可分為乳頭狀甲狀腺癌、濾泡型癌、髓樣癌、未分化癌、轉移癌。濾泡狀甲狀腺癌約占甲狀腺癌的10%。研究發現，NRAS基因突變和濾泡狀病理類型明顯相關，NRAS突變的患者更容易出現遠處轉移，這提示NRAS基因分子特征與甲狀腺癌的發生發展及治療、預后密切相關，應引起重視，并廣泛應用于臨床診療，以提高甲狀腺癌患者的生存率，改善生活質量。

黑色素瘤是一種來源于黑色素細胞的惡性腫瘤，在中國，黑色素瘤的發病率為0.6/10萬。黑色素瘤雖然發病率不高，卻是皮膚腫瘤中惡性程度高的瘤種。隨著黑色素瘤生長，癌細胞會滲透到皮膚和粘膜中，最終到達血管或淋巴通道，并迅速傳播到整個身體和主要器官。NRAS是黑素瘤中第2個最常見的突變基因，約15%～25%的黑色瘤中存在NRAS突變，尤其在肢端型（亞洲最常見的黑色素瘤亞型）及非慢性日光損傷型黑色素瘤中，NRAS基因為主要突變基因。其中NRAS基因最常見的突變位點位于第3外顯子的61位密碼子，包括Q61K、Q61R、Q61L、Q61H。NRAS突變是黑色素瘤發生的早期事件，且NRAS突變的黑色素瘤總體生存率比其野生型更低，MEK抑制劑被發現在NRAS突變的黑色素瘤有一定的療效。

由于NRAS基因突變在以上疾病診療中的重要作用，目前對于NRAS基因突變狀態的檢測已成為輔助腫瘤診斷和治療的重要手段之一。臨床上基因突變檢測的金標準是Sanger測序法，此方法的優點是實驗方法簡單，結果直觀可靠，成本較低。經過幾十年的臨床應用，已經得到廣大醫務人員的認可，但該技術檢測靈敏度較不高，且檢測周期較長。隨著熒光定量PCR技術的發展，越來越多的相關基因檢測產品被推上市場，相比Sanger測序法，熒光PCR技術僅需2小時即可得到檢測結果，分辨率可低至1%，具有明顯的優勢。鑒于此，特提出本申請。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種檢測人NRAS基因突變的PCR試劑盒，本試劑盒采用ARMS-PCR的方法，分別設計了針對Q61H、Q61K、Q61L、Q61R位點特異性的引物和探針；