[發明專利]一種同時檢測新冠肺炎康復者恢復期血漿中SARS-CoV-2病毒及其他病原體的方法

有效

• 申請號: 202010514140.6
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111549183B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 王月;喻劍虹;楊曉明;李策生;何彥林;余鼎;劉瑩;羅艷;胡勇;張林林;韓韌;趙傳波;郭佳茹;張雪;陳鄂湘;彭干;向陽;陳玲;李耀雄
• 申請（專利權）人: 國藥集團武漢血液制品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

1.一種同時檢測血漿樣品中SARS-CoV-2病毒、和多種其他病原體的檢測試劑盒，所述的試劑盒包括：

(1)檢測SARS-CoV-2病毒的引物組，

(2)檢測多種其他病原體的檢測引物組，

(3)必要的核酸提取試劑及顯色試劑；

所述的檢測SARS-CoV-2病毒的引物組為如下兩組熒光PCR引物組：

SARS-CoV-2靶標一(orf1ab):TEXAS RED610-BHQ2熒光信號組

SEQIDNO.1：正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

SEQIDNO.2：反向引物(R)：ACGATTGTGCATCAGCTGA

SEQIDNO.3：熒光探針(P)：CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG，且該探針5'端為TEXASRED610，3'端為BHQ2；

SARS-CoV-2靶標二(N):FAM-BHQ1熒光信號組

SEQIDNO.4：正向引物(F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

SEQIDNO.5：反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

SEQIDNO.6：熒光探針(P)：TTGCTGCTGCTTGACAGATT，且該探針5'端為FAM，3'端為BHQ1；

所述的檢測多種其他病原體的引物組為

1)ROX-BHQ1熒光信號組

呼吸道合胞病毒A型引物組：

SEQIDNO.7：正向引物(F)：TGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTG

SEQIDNO.8：反向引物(R)：TCTCCTGTGCTCCGTTGGAT

SEQIDNO.9：熒光探針(P)：CATCCAGCAAATACAC，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

腺病毒引物組:

SEQIDNO.10：正向引物(F)：ATGGCCACCCCTTCGATGA

SEQIDNO.11：反向引物(R)：CCCGGACTCAGGTACTCCGA

SEQIDNO.12：熒光探針(P)：TACATGCACATCGCCGG，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

人偏肺病毒引物組:

SEQIDNO.13：正向引物(F)：GCAACATGAAATAATGAAGAATGTACAC

SEQIDNO.14：反向引物(R)：GAGTGCTAATGTTTTTACTCCTCGTTAA

SEQIDNO.15：熒光探針(P)：TGAGCTCACACTATTGAA，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

呼吸道合胞病毒B型引物組:

SEQIDNO.16：正向引物(F)：GCTTGATGTCAGTTGTGGAACAAT

SEQIDNO.17：反向引物(R)：TGTATCTCATTCAGCTTCGGTATGA

SEQIDNO.18：熒光探針(P)：CACAAACATATGTCCTAATAGA，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

甲型流感病毒引物組:

SEQIDNO.19：正向引物(F)：CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC

SEQIDNO.20：反向引物(R)：TCATATCCACTGGCCACGGCAAG

SEQIDNO.21：熒光探針(P)：CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

乙型流感病毒引物組:

SEQIDNO.22：正向引物(F)：CCAGGGATTGCAGACATTGAAGA

SEQIDNO.23：反向引物(R)：TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACT

SEQIDNO.24：熒光探針(P)：TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

副流感病毒1型引物組:

SEQIDNO.25：正向引物(F)：ACCCGAAATGACAATTCC

SEQIDNO.26：反向引物(R)：GGATCATGATAATGAAGGACAA

SEQIDNO.27：熒光探針(P)：TACACCAGCAGGAAGGACACA，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

副流感病毒2型引物組:

SEQIDNO.28：正向引物(F)：CCAACTATCGATTTGCTG

SEQIDNO.29：反向引物(R)：ATCCGGTAGTATTTAGTAGG

SEQIDNO.30：熒光探針(P)：AATGAGTCCAACCGAACCAATCC，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

副流感病毒3型引物組:

SEQIDNO.31：正向引物(F)：ACCAGGAAACGATGAATG

SEQIDNO.32：反向引物(R)：GGGTTCACTCTCGATTTC

SEQIDNO.33：熒光探針(P)：AGTATGACAGATGACACAATGCTCC，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

副流感病毒4型引物組:

SEQIDNO.34：正向引物(F)：GGTACAATTGCTCTTGGTG

SEQIDNO.35：反向引物(R)：ACTGCCTCATTTGTTTCTG

SEQIDNO.36：熒光探針(P)：ACAAGTTACAGCAGCAATCGGTC，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

博卡病毒引物組:

SEQIDNO.37：正向引物(F)：GGAGAGGAAGAGACACTG

SEQIDNO.38：反向引物(R)：GGTGTTCCTGATGATATGAG

SEQIDNO.39：熒光探針(P)：TCATCACAGGAGCAGGAGCC，且該探針5'端為ROX，3'端為BHQ1；

2)Cy5-BHQ2熒光信號組

嗜肺軍團桿菌引物組:

SEQIDNO.40：正向引物(F)：TCCTAGTAGTGAAGATGAATGTAATGATGT

SEQIDNO.41：反向引物(R)：AACTTAATATGAGATTTTCCCGCTGCCAACAA

SEQIDNO.42：熒光探針(P)：TGCTGCGGTACCCTGCGATTC，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

百日咳鮑特菌引物組:

SEQIDNO.43：正向引物(F)：GGCATCAAGCACCGCTTTAC-

SEQIDNO.44：反向引物(R)：CGGTGTTGGGAGTTCTG

SEQIDNO.45：熒光探針(P)：CGTGCCTGACTACTAGT，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

鼻病毒引物組:

SEQIDNO.46：正向引物(F)：AGACCAATAGTAGGCAAC

SEQIDNO.47：反向引物(R)：CCTACTAAGCTCTGTGTA

SEQIDNO.48：熒光探針(P)：TCCAGGTTGTCTAAGGTCAAGCAC，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

腸病毒引物組:

SEQIDNO.49：正向引物(F)：CGAACTCAGCATCAGAAG

SEQIDNO.50：反向引物(R)：TCTCGTGTATGACATCCA

SEQIDNO.51：熒光探針(P)：ACTACACCACCATCAACTATTACAACG，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

肺炎衣原體引物組:

SEQIDNO.52：正向引物(F)：TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGG

SEQIDNO.53：反向引物(R)：GTGTGTACAAGGCCCGAGAAC

SEQIDNO.54：熒光探針(P)：TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

肺炎支原體引物組:

SEQIDNO.55：正向引物(F)：GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT

SEQIDNO.56：反向引物(R)：ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCA

SEQIDNO.57：熒光探針(P)：TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

冠狀病毒OC43引物組:

SEQIDNO.58：正向引物(F)：GCCTATCAACAACAAGATG

SEQIDNO.59：反向引物(R)：GCAACACTTATATTATCATTTTCTC

SEQIDNO.60：熒光探針(P)：CTTATGACCACGCTGACGCTG，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

冠狀病毒NL63引物組:

SEQIDNO.61：正向引物(F)：GTCGTTCTTCAACTCGTAA

SEQIDNO.62：反向引物(R)：AAGCCAAAGTAACAGCAG

SEQIDNO.63：熒光探針(P)：CTTCTCGTAGCACTTCAAGACAACAG，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

冠狀病毒HKU1引物組:

SEQIDNO.64：正向引物(F)：AGCTGACACTTCTACTCC

SEQIDNO.65：反向引物(R)：GAACCTGGTCGACTATTAG

SEQIDNO.66：熒光探針(P)：AGACCTTCCTGAGCCTTCAACAT，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

冠狀病毒C229E引物組:

SEQIDNO.67：正向引物(F)：GTGGATTTGTCACCCAAG

SEQIDNO.68：反向引物(R)：CCTGTAGGTTCAGTTTTAGC

SEQIDNO.69：熒光探針(P)：CAGACGACACCTTCAACACGC，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

HIN1引物組:

SEQIDNO.70：正向引物(F)：GTGGATTTGAGATGATTTG

SEQIDNO.71：反向引物(R)：GCAGTTCATTCCTGTTAA

SEQIDNO.72：熒光探針(P)：AACTTCCACTGTATCCTGACCAATCA，且該探針5'端為Cy5，3'端為BHQ2；

所述的同時檢測SARS-CoV-2病毒和多種病原微生物為，經過一次核酸提取后，樣本進行兩次實時熒光PCR檢測，分別確定樣本中的SARS-CoV-2病毒和多種病原微生物；

所述的試劑盒還包括，

(4)必要的樣本提取內部質控核酸樣本，

所述的內部質控核酸樣本用于同時對SARS-CoV-2病毒的樣本檢測和多種病原微生物樣本的檢測進行質量監控，確定PCR反應前，提取核酸樣本的過程沒有系統錯誤；

所述的內部質控核酸樣本為含有一段HIV-1目的基因RNA片段的MS2噬菌體；

在對待測血漿進行預處理時，使用蛋白酶K裂解血漿樣本后，即加入內部質控核酸樣本；

(5)用于檢測多個熒光通道是否能夠正常顯色的AC擴增質控，

所述的AC擴增質控核酸在樣本核酸提取完畢后，進行PCR擴增前加入。