[發明專利]一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法

有效

• 申請號: 202010513468.6
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111607004B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 王鵬;孫磊;鄭之明;呂薈;王麗;王晗;趙根海
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/02
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，該多肽的精氨酸的兩側均設有一半胱氨酸，兩個半胱氨酸形成二硫鍵，且所述二硫鍵橫跨所述精氨酸。本發明對多肽中需進行保護的精氨酸的兩側，選擇適當的位點插入半胱氨酸或者將不重要的氨基酸突變為半胱氨酸，使兩個半胱氨酸橫跨擬保護的精氨酸形成二硫鍵。通過二硫鍵帶來的構象變化，在酶切處形成空間位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的親和力，大幅減弱甚至消除酶切效應。

技術領域

本發明屬酶工程技術領域，涉及一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法。

背景技術

胰蛋白酶是肽鏈內切酶，其酶切位點為/K/R-\P，可以對蛋白質氨基酸序列中的精氨酸和賴氨酸的C端進行酶切(如精氨酸/賴氨酸后面跟的是脯氨酸則不會發生酶切)。在酶切反應中，為了防止肽鏈中的賴氨酸被胰蛋白酶酶切，通常使用檸康酸酐或者馬來酸酐與賴氨酸側鏈上的ε氨基進行反應，保護賴氨酸C端不被胰蛋白酶酶切。但對于肽鏈中的精氨酸沒有很好的保護手段，只能將精氨酸突變為其他氨基酸。如果氨基酸序列中精氨酸所處位置接近該蛋白本身的活性中心位點，或其本身為發揮其活性的關鍵殘基，該突變可能導致目標蛋白的活性降低甚至失活。因此，有必要設計一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供的技術方案是：一種在胰蛋白酶酶切過程中選擇性保護酶切位點的方法，包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，該多肽的精氨酸的兩側均設有一半胱氨酸，兩個半胱氨酸形成二硫鍵，且所述二硫鍵橫跨所述精氨酸。

優選的技術方案為：所述半胱氨酸為插入或突變得到。

優選的技術方案為：在精氨酸的兩側均插入一半胱氨酸；或者將精氨酸的兩側的不重要的氨基酸突變為半胱氨酸；或者在精氨酸的一側插入一半胱氨酸，另一側的不重要的氨基酸突變為半胱氨酸；使兩個半胱氨酸橫跨待保護的精氨酸形成二硫鍵。

優選的技術方案為：兩個半胱氨酸間隔的氨基酸數目為n，n為大于或等于1，小于20的整數。

優選的技術方案為：兩個半胱氨酸間隔的氨基酸數目為n，n為大于或等于5，小于19的整數。

優選的技術方案為：所述多肽的序列為SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3或SEQ?ID?NO.4。

由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有的優點是：

本發明對多肽中需進行保護的精氨酸的兩側，選擇適當的位點插入半胱氨酸或者將不重要的氨基酸突變為半胱氨酸，使兩個半胱氨酸橫跨擬保護的精氨酸形成二硫鍵。通過二硫鍵帶來的構象變化，在酶切處形成空間位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的親和力，大幅減弱甚至消除酶切效應。

附圖說明

圖1為多肽一酶切前后分子量檢測圖譜。

圖2為多肽二酶切前后分子量檢測圖譜。

圖3為多肽三酶切前后分子量檢測圖譜。

圖4為多肽一序列。

圖5為多肽二序列。

圖6為多肽三序列。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點及功效。