[發明專利]一種增強植物生存能力的方法

在審

• 申請號: 202010512039.7
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111635903A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 郭東林;董曉雨;周思瑩;石卓;李洪
• 申請（專利權）人: 哈爾濱師范大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種增強植物生存能力的方法，其特征在于，所述方法通過構建紫花苜蓿YSL6基因作為植物基因表達載體的質粒，并該質粒轉化農桿菌與植物小苗共同培養，得到轉基因植物小苗，進而提高植物中鐵含量和儲鐵能力，增強植物生存能力。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：

S1：采用PCR技術從紫花苜蓿中克隆出紫花苜蓿的YSL6基因；

S2：構建植物的基因表達載體Pbi121-Ms YSL6質粒；

S3：將Pbi121-Ms YSL6 質粒轉化為農桿菌；

S4：將植物小苗與所述Pbi121-Ms YSL6質粒共培養，培養后進行芽誘導、生根誘導及移栽馴化，最終得到具有強生存能力的轉基因植物小苗。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1具體包括：

S11：提取紫花苜蓿RNA；

S12:通過提取紫花苜蓿RNA為模板，利用反轉錄PCR的方法獲得cDNA；

S13：膠回收目標基因條帶：采用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴增得到的目標基因片段Ms YSL6；

S14：構建克隆載體 pMD18T-MsYSL6：連接 Ms YSL6 目的基因片段到克隆載體pMD18T上，連接產物利用熱激法轉入到大腸桿菌感受態中；

S15：對Ms YSL6基因測序并利用生物信息學進行分析。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述S11具體包括：

S111：將0.1 g紫花苜蓿全株放入經液氮預冷的研缽中，研磨至細碎的粉末狀；

S112：將粉末轉移到1.5 mL的無菌離心管中，加入450μL RL；

S113：將所有液體轉移至過濾柱中，12000 rpm離心5 min，小心吸取上清至新的RNase-Free的離心管中；

S114：緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱中，12000 rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中；

S115：向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm離心60s，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；

S116：配制DNase工作液：取10 μL的DNaseⅠ反應液中加入70μL RDD溶液，輕柔混勻；

S117：將80 μLDNase工作液加入到吸附柱濾膜上，靜置15 min；

S118：向離心吸附柱中加入350 μL去蛋白液，12000 rpm離心60s，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；

S119：向離心吸附柱中加入300 μL漂洗液，室溫靜置2 min，12000 rpm離心60 s，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；

S1110：重復步驟S119；

S1111：12000 rpm離心2 min，棄濾液，將吸附柱置于室溫放置5 min，以徹底晾干吸附柱中殘留的漂洗液；

S1112：將離心吸附柱轉移至RNase-free收集管中，加入30 μL RNA洗脫液靜置1-2min，12000 rpm離心2 min，收集管中即為RNA樣品，-80℃保存。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述S14具體包括：

S141：大腸桿菌感受態從-80 ℃冰箱中取出后迅速放到冰上，待其溶化后加入20 ul的連接產物，冰浴30 min；

S142：取出后快速放于42 ℃水浴熱激1 min 15 s后，迅速插入冰中，冰浴2 min，加入800 ul LB液體培養基，置于200 rpm搖床，37 ℃，振蕩1 h；

S143：取出離心管，4000 rpm離心5 min，取出上清800 ul，重懸剩余菌體，將剩余約200ul的菌液以3:1的比例涂于含有氨芐抗性的兩個LB固體培養基上；

S144：37 ℃培養箱中倒置培養，過夜；挑取培養基上的單菌落進行鑒定。