[發(fā)明專利]基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子外泌體的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010512024.0
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111543637B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡路昀;曹愛玲;曹敏杰;劉東紅;李秀霞
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: A23L33/105
• 分類號: A23L33/105
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發(fā)明公開了一種基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子外泌體的構(gòu)建方法，屬于保健食品領(lǐng)域，該方法通過提取褐藻外泌體，并對其進(jìn)行表面修飾，最終包覆功能因子，能夠獲得負(fù)載疏水性活性成分的外泌體、負(fù)載親水性活性成分的外泌體以及負(fù)載兩親性活性成分的外泌體。該負(fù)載功能因子外泌體能夠靶向肝臟，具有靶向性強(qiáng)、毒性低、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于保健食品領(lǐng)域，具體地涉及一種基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子外泌體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

食品中的活性成分例如黃酮類化合物、酚酸、萜類化合物、類胡蘿卜素等有著較強(qiáng)的抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗微生物等生理功能，能夠參與人體生理及病理的調(diào)節(jié)和慢性病的防治，對人體的健康發(fā)揮著重要的作用?；钚猿煞謱Ω闻K的各種疾病例如慢性乙型肝炎、脂肪肝、肝衰竭、肝硬化等有著較好的防治作用，但是這些活性成分都易快速降解和失活，且有著較差的靶向性和生物利用度，需要包封在一些載體中，研究廣泛的載體有乳液、脂質(zhì)體、納米粒、微膠囊等，但是這些材料雖然較好地解決了活性成分不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，但是依然沒有解決靶向性差的缺陷，而且均存在一定的安全性問題。

外泌體作為活性物質(zhì)的載體具有很多優(yōu)勢，比如外泌體更易儲存且安全性較高，能提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，具有較強(qiáng)的穿透各種生物屏障的能力，且可以避免免疫系統(tǒng)的吞噬。對于外泌體的提取，如今使用比較廣泛的原材料有姜、蒜、葡萄、牛奶等，還沒有發(fā)現(xiàn)研究褐藻中外泌體的提取與應(yīng)用的相關(guān)報道，且無外泌體負(fù)載活性成分靶向肝臟的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明目的是提供一種基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子外泌體的構(gòu)建方法，構(gòu)建可靶向肝臟的包埋食品活性成分的外泌體載體，具有靶向性強(qiáng)、毒性低、生物利用率高等特點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子疏水性外泌體的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

(1)將新鮮的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下勻漿1-2min，得到褐藻汁，將褐藻汁過濾，收集濾液，將濾液分別在1000g下離心10min、2000g下離心20min、4000g離心30min、10000g離心1h，收集上清液，將上清液用體液外泌體提取試劑盒進(jìn)行提取純化，得到褐藻外泌體溶液，將褐藻外泌體溶液溶解于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，使得褐藻外泌體溶液的濃度為1-3mg/mL，得到外泌體-磷酸鹽緩沖溶液。

(2)將1-3mg的配體和1-2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶解于0.1-0.15mL的二甲基亞砜(DMSO)中，并在45-55℃保持10-20min，隨后冷卻至20-25℃，加入步驟1得到的外泌體-磷酸鹽緩沖溶液2-4mL，反應(yīng)2h后，得到綴合物，采用蔗糖梯度溶液進(jìn)行純化，并將純化后的外泌體溶解在PBS中，得到外泌體分散液。所述配體為膽酸、甘草酸、甘草次酸或甘露糖。

(3)將0.5-1.5mg/mL疏水性活性成分溶液與步驟2獲得的外泌體分散體混合，并保持溶質(zhì)濃度≥10wt％，在室溫下放置12-18min，然后以10000g的速度離心10min，再通過在4℃下以135000g的速度離心90min，收集沉淀即為負(fù)載疏水性活性成分的外泌體。所述疏水性活性成分溶液的溶劑由乙腈與乙醇按體積比1：1組成。所述疏水性活性成分溶液中的溶質(zhì)為多酚、類黃酮、異類黃酮、胡蘿卜素及其衍生物、疏水性維生素、蛋白或多糖等。

本發(fā)明還提供了一種基于褐藻的可靶向肝臟緩釋功能因子親水性外泌體的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

(1)將新鮮的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下勻漿1-2min，得到褐藻汁，將褐藻汁過濾，收集濾液，將濾液分別在1000g下離心10min、2000g下離心20min、4000g離心30min、10000g離心1h，收集上清液，將上清液用體液外泌體提取試劑盒進(jìn)行提取純化，得到褐藻外泌體溶液，將褐藻外泌體溶液溶解于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，使得褐藻外泌體溶液的濃度為1-3mg/mL，得到外泌體-磷酸鹽緩沖溶液。