[發明專利]一種培育腸道特異性表達紅色熒光轉基因斑馬魚的方法

在審

• 申請號: 202010511231.4
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111621522A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 單穎;李肖梁;方維煥
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種培育腸道特異性表達紅色熒光轉基因斑馬魚的方法，其特征在于，是以Tol2轉座酶系統為工具，構建以腸道脂肪酸結合蛋白啟動子帶動DsRed紅色熒光蛋白在腸道特異表達的轉基因斑馬魚；該方法具體包括以下步驟：

(1)從斑馬魚腸道組織基因組擴增獲得腸道特異性啟動子Pifabp，其序列如SEQ IDNO:1所示；

(2)從商品化質粒中擴增獲得dsred片段，其序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)以mini Tol2質粒為骨架，構建基于腸道特異性啟動子Pifabp表達紅色熒光蛋白dsred的重組表達載體；

(4)將步驟(3)中的重組表達載體顯微注射至斑馬魚受精卵，篩選出存在紅色熒光信號的胚胎，并按常規方法飼養，得到F0代；

(5)將F0代斑馬魚與野生型斑馬魚雜交獲得F1代，篩選獲得雜合的腸道特異性表達紅色熒光轉基因斑馬魚；

(6)將F1代斑馬魚進行自交獲得F2代，篩選得到純合及雜合的腸道特異性表達紅色熒光轉基因斑馬魚；

(7)將F2代斑馬魚與野生型斑馬魚測交，篩選出后代100％腸道表達紅色熒光蛋白對應的F2代親本斑馬魚，作為純品系留種保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，啟動子Pifabp的擴增過程包括：

(1.1)從成年斑馬魚的腸道組織中獲取基因組DNA；

(1.2)設計并合成巢式PCR引物，其序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:6所示；

(1.3)以步驟(1.1)中提取的斑馬魚基因組為模板，利用步驟(1.2)所述引物進行兩輪巢式PCR擴增，PCR產物經分離鑒定后進行回收純化。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，dsred片段的擴增過程包括：

(2.1)根據dsred商品化質粒的圖譜，設計并合成特異性引物，其序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示；在所述引物上加懸掛序列，用于與ifabp啟動子及pTol2質粒融合；

(2.2)以dsred商品化質粒為模板，利用步驟(2.1)所述引物進行PCR擴增，PCR產物經分離鑒定后進行回收純化。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，構建重組表達載體的過程包括：

(3.1)以純化的啟動子Pifabp和dsred片段為模板進行融合PCR，PCR產物經分離鑒定后進行回收純化；

(3.2)根據miniTol2質粒圖譜，設計并合成特異性引物，其序列如SEQ ID NO:9-SEQ IDNO:10所示；在所述引物上加懸掛序列，用于PCR擴增獲得用于克隆的線性化質粒；

(3.3)以miniTol2質粒為模板，利用步驟(3.2)所述引物進行PCR擴增，獲得用于克隆的線性化質粒，PCR產物經分離鑒定后進行回收純化；純化產物用DpnI酶切，去除質粒模板，并將酶切產物純化回收；

(3.4)利用步驟(3.1)所得Pifabp-dsred融合片段和步驟(3.3)所得線性化質粒進行一步克隆，然后將克隆質粒轉化入大腸桿菌DH5α感受態中；

(3.5)挑取單菌落進行培養，以Pifabp-dsred融合片段為陽性對照，取菌液進行PCR鑒定；對PCR產物鑒定為陽性克隆的進行測序比對，保存測序完全正確的陽性克隆對應的菌液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，在斑馬魚受精卵產下后1小時內，將步驟(3)獲得的重組表達載體通過顯微注射導入斑馬魚單細胞階段受精卵中；按常規方法飼養，將其定為F0代。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，待F0代發育至性成熟后，將其與WB野生型斑馬魚進行測交；獲取3dpf及5dpf的胚胎，觀察并篩選腸道中有紅色熒光特異性表達的胚胎；按常規方法飼養，并將其定為F1代。