[發明專利]一種DC-CIK細胞制劑及其制備方法

在審

• 申請號: 202010510549.0
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111690611A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 王曉宇;李崴;郭康合;李翠云;林冠妃
• 申請（專利權）人: 海南優尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783;A61K35/15;A61K35/17;A61P31/20;A61P1/16
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 陳月婷

1.一種DC-CIK細胞制劑，其特征在于：包括DC-CIK細胞、20％人血白蛋白和溶劑。

2.根據權利要求1所述的一種DC-CIK細胞制劑，其特征在于：所述DC-CIK細胞的濃度為每毫升(0.5-2)×10⁷個細胞，所述20％人血白蛋白的含量為體積分數1％-4％，所述溶劑為120-200ml的0.9％生理鹽水。

3.根據權利要求2所述的一種DC-CIK細胞制劑，其特征在于：所述的DC-CIK細胞是通過將自體來源的外周血分離的單個核細胞分別誘導培養成DC細胞和CIK細胞，再共同培養獲得，所述DC細胞在培養過程中添加粒細胞-巨噬細胞集落刺激生長因子、白細胞介素-4和HBsAg；所述CIK細胞在培養過程中添加抗CD3單克隆抗體、γ-干擾素、白細胞介素-2和自體血漿，所述DC-CIK細胞在培養過程中添加白細胞介素-2和自體血漿，所述培養基為添加80000單位慶大霉素的GT-T551基礎培養基。

4.根據權利要求3所述的一種DC-CIK細胞制劑，其特征在于：所述的DC細胞在T75培養瓶中培養，所述的CIK細胞前期在T175培養瓶中培養，待細胞數量達到3×10⁸后將部分細胞轉移到2L培養袋中擴大培養，所述DC-CIK細胞的培養在T175培養瓶和2L培養袋中進行。

5.一種由權利要求1-4任一項所述的一種DC-CIK細胞制劑的制備方法，其特征在于，包括以下制備步驟：

1)采集外周血至含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋中，無菌條件下轉移至50ml離心管中，利用離心機進行離心，離心條件：4℃，1800-2200rpm，12-20min，取上層淡黃色血漿至新的50ml離心管中置于56℃水浴鍋中滅活30min，利用離心機進行離心分離，離心條件：4℃，3000-3500rpm，離心3-8min收集上清液，即為自體血漿，置于4℃冰箱備用；

2)向外周血離心后的下層紅色液體中加入等體積的生理鹽水進行稀釋吹打混勻，用移液器緩慢地將20-25ml稀釋后的血液緩慢加入到含20ml淋巴細胞分離液的離心管中，使血液和淋巴細胞分離液形成明顯分層，利用離心機進行離心分離，離心條件：4℃，1800-2500rpm離心15-25min，吸取底部紅細胞上層的所有液體并轉移至新的50ml離心管中，再次利用離心機進行離心分離，離心條件：4℃，1800-2500rpm離心3-8min；棄上清液，用40ml生理鹽水清洗細胞，取0.5ml細胞懸液用于細胞計數計算細胞回收率，剩余細胞懸液利用離心機離心洗滌，離心條件：4℃，1800-2500rpm離心3-8min，離心所得沉淀即為外周血單個核細胞；

3)用10ml培養基將上述外周血單個核細胞重懸接種到含5ml培養基的T75培養瓶中，置于37℃、5％CO₂培養箱培養2-6h；

4)DC細胞的體外誘導、擴增：外周血單個核細胞培養2-6h后，收集非貼壁細胞至50ml離心管中備用，在剩余含貼壁細胞的培養瓶中，加入15-25ml培養基、500-1000U/ml粒細胞-巨噬細胞集落刺激生長因子、500-1000U/ml白細胞介素-4，置于37℃、5％CO₂培養箱培養，第3天半量換液1次并補充粒細胞-巨噬細胞集落刺激生長因子和白細胞介素-4，第5天再次半量換液補充粒細胞-巨噬細胞集落刺激生長因子和白細胞介素-4后加入濃度20-150μg/L的HBsAg誘導以獲得HBsAg致敏的DC細胞，繼續培養；

5)CIK細胞的體外誘導、擴增：將外周血單個核細胞培養2-6h后收集的非貼壁細胞接種到T175培養瓶中，用血細胞技術儀進行計數，根據細胞密度補充培養基、500-2000U/ml的白細胞介素-2、0.5-1mg/L抗CD3單克隆抗體、500-1000U/ml的γ-干擾素和5-15％自體血漿，調細胞濃度為(1-2)×10⁶/ml，置于37℃，5％CO₂培養箱培養24h后根據細胞密度補加培養基、500-2000U/ml的白細胞介素-2和5-15％自體血漿，繼續置于培養箱中培養，以后根據細胞密度每隔1-2天補液1次，同時補充500-2000U/ml的白細胞介素-2和5-15％自體血漿，細胞數量達到3×10⁸時將95％細胞轉移至2L培養袋其余細胞留在T175培養瓶，根據細胞密度補液，同時補充500-2000U/ml的白細胞介素-2和5-15％自體血漿，后置于37℃，5％CO₂培養箱中培養，以后根據細胞密度每隔1-2天補液1次，同時補充500-2000U/ml的白細胞介素-2和5-15％自體血漿，直至血漿全部補完，調整培養瓶和培養袋中的細胞濃度始終為(1-2)×10⁶個/ml；

6)DC細胞與CIK細胞共培養：第6-8天收獲CIK細胞和HBsAg致敏的DC細胞，計數后按(5-20):1混合，補充培養基和500-2000U/ml的白細胞介素-2后繼續培養，以后根據細胞密度每隔1-2天補液1次，同時補充500-2000U/ml的白細胞介素-2，始終調整細胞濃度為(1-2)×10⁶個/ml，于培養的第12-14天收集培養細胞，得到所述DC-CIK細胞；

7)DC-CIK細胞制劑制備：于培養的第12-14天開始收集DC-CIK細胞，根據細胞計數，收集三分之一體積細胞，轉移至250ml離心瓶中，4℃，1800-2200rpm離心3-8min，去上清液，生理鹽水重懸洗滌離心兩次，沉淀加3-5ml的20％人血白蛋白重懸，靜置1-5min后加10-30ml生理鹽水稀釋后過70μm細胞篩網后轉移到含生理鹽水的回輸袋中制備成120-200ml的細胞懸液，即為HBsAg誘導的DC-CIK細胞制劑。