[發(fā)明專利]一株大腸桿菌及其在合成巖藻糖基化寡糖中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010510190.7
• 申請日: 2020-06-05
• 公開（公告）號: CN111808790B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 倪志堅;廖迎雪;吳金勇;陳祥松;李翔宇;李忠奎;袁麗霞;姚建銘
• 申請（專利權）人: 武漢中科光谷綠色生物技術有限公司;中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/90;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 劉志敏;郝傳鑫

本發(fā)明公開了一種用于發(fā)酵合成巖藻糖基化寡糖的大腸桿菌的構建方法，包括步驟：(1)在原核宿主細胞中過表達編碼從頭合成GDP?L?巖藻糖所必需的酶的至少一種基因；(2)在原核宿主細胞中表達編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的外源基因；(3)在原核宿主細胞中降低或消除GDP?甘露糖水解酶活性；(4)在原核宿主細胞中降低或消除β?半乳糖苷酶活性。本發(fā)明通過所述方法構建了一種大腸桿菌，所述大腸桿菌在可用于制備巖藻糖基化寡糖。采用本發(fā)明構建的工程菌進行5L罐的巖藻糖基化寡糖(以2'?巖藻糖基乳糖為例)的發(fā)酵生產(chǎn)驗證，結(jié)果顯示2'?巖藻糖基乳糖(2'?FL)的生產(chǎn)水平最高可達50g/L。

技術領域

本發(fā)明涉及代謝工程技術領域，還涉及一株大腸桿菌，尤其是利用所述大腸桿菌合成巖藻糖基化寡糖的方法。

背景技術

目前巖藻糖基化人乳寡糖(2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、二巖藻糖基乳糖等)的生物合成必需三要素：核苷酸活化的巖藻糖GDP-L-巖藻糖(GDP-L-fucose，主要作為該合成反應的供體底物，正常情況下細胞內(nèi)水平極低，且不易大規(guī)模生產(chǎn)，價格昂貴)，受體糖(主要作為該反應中接受巖藻糖的底物，如乳糖、N-乙酰乳糖胺、巖藻糖基乳糖、乳-N-二糖、乳-N-四糖、唾液酸乳糖、二唾液酸乳糖等)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT，需要外源引入且高表達該酶，可以來源于幽門螺桿菌Helicobacter pylori、空腸彎曲桿菌Campylobacterjejuni、肝幽門螺桿菌Helicobacter hepaticus、鼬鼠螺桿菌Helicobacter mustelae、普通擬桿菌Bacteroides vulgatus ATCC8482以及大腸桿菌O86、O128、O126、O127等，在該合成反應中它能催化L-巖藻糖分子從GDP-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移到受體糖分子上，從而形成巖藻糖基化的人乳寡糖)；

在現(xiàn)有技術方案中，對于供體底物GDP-L-巖藻糖的生物合成目前已經(jīng)確定有兩種途徑：從頭途徑(De novo pathway)和救助途徑(Salvage pathway)。

從頭合成途徑(De novo pathway)主要起源于細菌的中央代謝活動，GDP-L-巖藻糖本身可以參與莢膜異多糖酸的生物合成，作為細胞壁的主要成分。該路徑主要以糖酵解中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸為起點，依次經(jīng)過ManA(mannose6-phosphate isomerase，甘露糖-6-磷酸異構酶)，ManB(phosphomannomutase，磷酸甘露糖變位酶)，ManC(α-D-mannose-phosphate guanylyltransferase，α-D-甘露糖-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)，Gmd(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GDP-甘露糖4,6-脫氫酶)和Fcl(GDP-L-fucosesynthase，GDP-L-巖藻糖合成酶)五個酶促反應步驟，生成中間體GDP-L-巖藻糖。整個反應過程中，1摩爾葡萄糖轉(zhuǎn)化成1摩爾GDP-L-巖藻糖，并消耗1摩爾GTP和NADPH作為輔因子。在此基礎上，只要外源引入特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和受體糖底物，理論上就能催化合成所需的巖藻糖基化的人乳寡糖。

補救合成途徑(Salvage pathway)最初源于哺乳動物細胞和一些擬桿菌的代謝系統(tǒng)。該途徑從L-巖藻糖開始，胞外L-巖藻糖被轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)，再依次通過L-巖藻糖激酶和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶的催化作用合成GDP-L-巖藻糖。目前已經(jīng)公開了一種來源于脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的雙功能酶(Fkp)可以同時含有L-巖藻糖激酶活性和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶活性，這無疑促進了GDP-L-巖藻糖代謝工程化合成的可行性。整個反應過程中，1摩爾L-巖藻糖可以轉(zhuǎn)化成1摩爾GDP-L-巖藻糖，同時消耗1摩爾ATP和GTP作為輔因子。整體上看，補救合成路徑要相對簡單，但是所需要的底物L-巖藻糖不易獲得，且市場價格較高，因此該路徑目前還不適合規(guī)模化的巖藻糖基化寡糖的生產(chǎn)。