[發明專利]一種含有lpxM基因的重組質粒及其制備方法和重組大腸桿菌

在審

• 申請號: 202010501799.8
• 申請日: 2020-06-04
• 公開（公告）號: CN111560393A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 郭美錦;張寧;洪琦;韋炎龍
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

1.一種含有lpxM基因的重組質粒pCC1L，其特征在于，所述重組質粒pCC1L為在質粒pCC1FOS的基礎上連接有lpxM基因。

2.一種根據權利要求1所述的重組質粒pCC1L的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)質粒pET3b-lpxM的構建步驟如下：

①目的基因的擴增：以含有lpxM基因的目的片段為模板，以lpxM3和lpxM5為引物，PCR擴增至1.2kb片段；

LPXM5：AAGAAGGAGATATACATatggaaacgaaaaaaaataatagc；

LPXM3：TTAGCAGCCGGATCCttatttgatgggataaagatcttt；

②質粒pET3b的擴增：以質粒pET3b為模板，以pET5和pET3為引物，PCR擴增至4.6kb片段；

pET5：GGATCCGGCTGCTAACAAA；

pET3：ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTA；

③體外重組：將含有lpxM基因的目的片段連接至所述質粒pET3b上，得到質粒pET3b-lpxM；

④轉化，鑒定：

將重組得到的質粒pET3b-lpxM轉化到感受態DMT涂布AmpR平板；以T7/T7t為引物進行PCR鑒定；鑒定含有1.2kb的片段為陽性克隆，提取質粒pET3b-lpxM；

T7：TAATACGACTCACTATAGGG；

T7t：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；

(2)重組質粒pCC1L的構建步驟如下：

以所述質粒pET3b-lpxM為模板，以BI5和BI3為引物，PCR擴增至1.2kb，電泳膠回收LPXMCC片段，與pCC1FOS體外重組獲得質粒pCC1L；

BI5：GTTTTCCCAGTCACGACAAGGAGATGGCGCCCAA；

BI3：CCATGATTACGCCAAGCCGGATATAGTTCCTCCTTT。

3.一種包含如權利要求1或2所述的重組質粒pCC1L的重組大腸桿菌，其特征在于，通過將所述重組質粒pCC1L轉化至大腸桿菌DH416中制得。

4.根據權利要求3所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌采用25μg/mL的氯霉素(Cm)進行篩選。

5.根據權利要求3所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌的發酵方法，包括如下步驟：

1)培養：

對轉化有重組質粒pCC1L的重組大腸桿菌進行培養，具體為：挑取單菌落至含有5mL液體LB培養基的大試管中，在37℃，220rpm下孵育10-12h；在42℃的條件下消除輔助質粒；

2)發酵：

挑取單菌落至含有5mL的液體LB培養基的大試管中，在30℃、220rpm條件下過夜培養；次日，轉接至自誘導培養基中培養，使發酵初始OD₆₀₀為0.05，在30℃、220rpm條件下培養24h。

6.根據權利要求5所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述LB培養基包括：蛋白胨、酵母粉和NaCl。

7.根據權利要求6所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述LB培養基包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L的NaCl。

8.根據權利要求5所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述自誘導培養基包括：蛋白胨、酵母粉、NaH₂PO₄·2H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、NaCl、吐溫80、甘油、MgSO₄、葡萄糖、L-阿拉伯糖；其中，所述MgSO₄與所述葡萄糖單獨配成母液。

9.根據權利要求8所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述自誘導培養基包括：15g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、3g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、7g/L的K₂HPO₄·3H₂O、2.5g/L的NaCl、5g/L吐溫80、10g/L甘油、50g/L的MgSO₄、200g/L葡萄糖、200g/L的L-阿拉伯糖；其中，所述MgSO₄與所述葡萄糖單獨配成母液。