[發(fā)明專利]一種提取單個(gè)搖蚊科蛹期蛻皮DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010501687.2
• 申請(qǐng)日: 2020-06-04
• 公開（公告）號(hào): CN111575277B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉文彬;閆春財(cái);孫小雅;龍辰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種提取單個(gè)搖蚊科蛹期蛻皮DNA的方法。屬于動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括如下步驟：預(yù)處理、裂解離心、洗脫、富集、酶解、抽提、離心、沉淀、溶解、擴(kuò)增和電泳檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：用蒸餾水處理用以去除雜質(zhì)，防止干擾提??；通過0.9％NaCl溶液緩慢的滲透作用影響，能使搖蚊蛹期蛻皮上殘存的細(xì)胞在溫和的狀態(tài)下，逐漸恢復(fù)生理活性，并促使細(xì)胞中交聯(lián)的蛋白質(zhì)與DNA逐步解離；采用本發(fā)明方法提取的搖蚊科蛹期蛻皮DNA濃度可達(dá)到0.908ng/μl，純度可達(dá)到1.89。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種提取單個(gè)搖蚊科蛹期蛻皮DNA的方法。

背景技術(shù)

搖蚊，為昆蟲綱雙翅目長角亞目昆蟲。因不同種屬之間生態(tài)要求和生活習(xí)性的多樣性，對(duì)環(huán)境因子敏感性的差異使得他們成為水環(huán)境生物監(jiān)測的優(yōu)良指示物。某些種類可攜帶病原體引起哮喘、霍亂、皮炎等疾病，危害人類健康，一些種類是重要的農(nóng)業(yè)和漁業(yè)害蟲，危害水稻、莼菜等農(nóng)作物。

搖蚊蛹期是正在發(fā)育中的、具有雙層體壁的成蟲雛體，它銜接了幼蟲和成蟲兩個(gè)階段，既與兩個(gè)蟲態(tài)有部分相似的結(jié)構(gòu)、性狀，又具獨(dú)特的形態(tài)特征和生活習(xí)性。蛹期研究在搖蚊亞科高級(jí)階元研究中具有重要價(jià)值。此外，搖蚊蛹期蛻皮能快速、全面的了解采集樣點(diǎn)的物種組成，其研究成果可廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)和生物多樣性等領(lǐng)域。

然而，由于不同屬種搖蚊科蛹期蛻皮形態(tài)差異較小，因此在搖蚊蛹的準(zhǔn)確鑒定方面存在一定困難。近年來，結(jié)合DNA條形碼技術(shù)對(duì)不同蟲期的配套研究已成為研究熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定方面。DNA條形碼技術(shù)可以有效解決搖蚊科不同蟲態(tài)配套、近緣種區(qū)分以及部分物種的快速鑒定問題。

DNA條形碼數(shù)據(jù)的獲得一般包括以下幾個(gè)步驟：提取總DNA，PCR擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳和微量蛋白核酸儀檢測，割膠回收純化，測序，分析和處理數(shù)據(jù)。其中，提取總DNA這一步非常關(guān)鍵，直接影響了后續(xù)擴(kuò)增、測序和鑒定的準(zhǔn)確性。

相對(duì)于幼蟲和成蟲，搖蚊蛹期蛻皮時(shí)殘留的DNA數(shù)量很少，使用傳統(tǒng)CTAB法重復(fù)10次依然無法提取出蛹皮DNA，僅存在痕量DNA。通過傳統(tǒng)的CTAB、SDS、NaCl和試劑盒法等提取DNA時(shí)前期DNA從蛹皮中無法完全脫離和有效富集，獲得的總DNA純度和質(zhì)量達(dá)不到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，目前常規(guī)提取DNA方法提取搖蚊蛹期蛻皮的平均DNA量為0.003ng/μl～0.020ng/μl,導(dǎo)致?lián)u蚊蛹皮的分子鑒定難以進(jìn)行。

綜上，如何提供一種質(zhì)量高、純度大的提取搖蚊科蛹期蛻皮痕量DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種提取單個(gè)搖蚊科蛹期蛻皮DNA的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種提取單個(gè)搖蚊科蛹期蛻皮DNA的方法，包括如下步驟：

(1)預(yù)處理：經(jīng)過蒸餾水除雜和0.9％NaCl溶液浸泡處理得到預(yù)處理搖蚊蛹期蛻皮；

用蒸餾水處理用以去除雜質(zhì)，防止干擾提取；

通過0.9％NaCl溶液緩慢的滲透作用影響，能使搖蚊蛹期蛻皮上殘存的細(xì)胞在溫和的狀態(tài)下，逐漸恢復(fù)生理活性，并促使細(xì)胞中交聯(lián)的蛋白質(zhì)與DNA逐步解離。

(2)裂解離心：取預(yù)處理搖蚊蛹期蛻皮加入裂解液進(jìn)行研磨，之后8000rpm離心1min，取上清液1；

(3)洗脫、富集：將所述上清液1經(jīng)過硅膠膜離心吸附柱洗脫后得到搖蚊蛹期蛻皮粗DNA；

洗脫液成分包括10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA，pH＝8.5；

(4)酶解：使用蛋白酶K和RNA酶對(duì)搖蚊蛹期蛻皮粗DNA進(jìn)行酶解，得酶解液；