[發明專利]生產L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒桿菌及其改造方法和應用

在審

• 申請號: 202010500387.2
• 申請日: 2020-06-04
• 公開（公告）號: CN111549051A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 滿在偉;郭靜;劉典典;戴嘉辰;許穎琦;姚智仁
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12P13/10;C12N1/21;C12R1/15
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

本發明公開了一種生產L?瓜氨酸和L?精氨酸的谷氨酸棒桿菌及其改造方法和應用，通過對谷氨酸棒桿菌基因組進行改造，在argR基因中插入大腸桿菌的argB_Ec基因獲得重組菌株。應用該改進的菌株進行發酵在發酵的過程中能夠同時生成L?瓜氨酸和L?精氨酸。

技術領域

本發明屬于基因改造領域，具體涉及一種生產L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒桿菌及其改造方法和應用。

背景技術

L-瓜氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸，參與尿素循環維持血氨平衡，同時具有抗氧化和穩定血壓等生理功能。因此，L-瓜氨酸在醫療藥品、食品和化妝品行業具有非常廣闊的應用前景。目前，L-瓜氨酸合成研究主要集中于酶轉化法和發酵法。酶轉化法是以L-精氨酸為底物利用精氨酸脫亞氨基酶催化生成L-瓜氨酸。底物L-精氨酸價格較高，因此酶轉化法具有底物成本高的問題。微生物直接發酵法生產L-瓜氨酸可使用葡萄糖等廉價底物，具有工藝簡單、成本低、環境污染小等優勢，因此近年來逐漸得到重視。

L-精氨酸是人和動物體內的一種半必需氨基酸，同樣參與尿素循環維持血氨平衡。是多種生物活性物質的合成前體，具有多種獨特的生理和藥理作用，在食品、醫藥和動物飼料等方面具有廣泛的應用。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)是一種兼性厭氧革蘭氏陽性安全菌株。隨著研究的深入尤其是代謝工程的發展，C.glutamicum廣泛應用于各種氨基酸、有機酸乃至生物燃料和生物基化學品等的發酵生產。C.glutamicum中L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和L-精氨酸存在于同一條合成代謝途徑，可稱之為L-精氨酸合成代謝途徑。該代謝途徑終產物為L-精氨酸，L-瓜氨酸則為L-鳥氨酸合成L-精氨酸代謝反應的中間產物。

C.glutamicum ATCC13032中L-精氨酸合成代謝途徑相關基因以基因簇argCJBDFRGH的形式存在于染色體上，分為兩個操縱子分別為argCJBDFR和argGH。L-瓜氨酸主合成途徑中所有酶的編碼基因則集中在argCJBDFR操縱子上。其中，由argB基因編碼的N-乙酰谷氨酸激酶為L-瓜氨酸與L-精氨酸合成的關鍵限速酶，同時，其活性受L-精氨酸反饋抑制，很低濃度的L-精氨酸即可嚴重抑制N-乙酰谷氨酸激酶的催化活性。由argR基因編碼的阻遏蛋白ArgR可抑制argCJBDFR和argGH操縱子的轉錄，從而抑制細胞中整條L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代謝途徑。因此，C.glutamicum ATCC13032細胞中L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代謝途徑受到精密的代謝調控，不會過量合成L-瓜氨酸或L-精氨酸。C.glutamicumATCC13032發酵培養過程中發酵液中不會積累L-瓜氨酸或L-精氨酸。只有解除細胞對L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代謝途徑的代謝調控作用，才能實現L-瓜氨酸和L-精氨酸的過量合成。來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的N-乙酰谷氨酸激酶活性則不受L-精氨酸反饋抑制，其編碼基因命名為argB_Ec。

發明內容

針對上述問題，本發明提出一種生產L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒桿菌及其改造方法和應用。

實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

一種改造谷氨酸棒桿菌生產L-瓜氨酸和L-精氨酸的方法，對谷氨酸棒桿菌基因組進行改造，在argR基因中插入大腸桿菌的argB_Ec基因。

作為本發明的進一步改進，采用PCR擴增argR基因上游片段argR_F、argR基因下游片段argR_R和argB_Ec基因獲得argR_F-argB_Ec-argR_R基因片段。

作為本發明的進一步改進，包括以下步驟：