[發明專利]一種生產尿苷的重組微生物及生產尿苷的方法

在審

• 申請號: 202010498760.5
• 申請日: 2020-06-04
• 公開（公告）號: CN113755414A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 江君君;田鋒;王欣彤;胡志浩
• 申請（專利權）人: 蘇州華賽生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/38;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/15;C12R1/225
• 代理公司: 蘇州啟華專利代理事務所(普通合伙) 32357
• 代理人: 徐偉華

本發明提供了一種生產尿苷的重組微生物以及利用該重組微生物生產尿苷的方法。其中，對尿苷的降解及利用基因進行了敲除，這些基因編碼核糖核苷水解酶，尿苷磷酸化酶，核苷磷酸化酶，胞苷/尿苷激酶以及核苷轉運蛋白。同時，對尿苷生物合成途徑中的關鍵酶進行了過表達，包括降解胞苷三磷酸到胞苷單磷酸的胞苷三磷酸焦磷酸化酶，以及催化尿苷單磷酸到尿苷的尿苷單磷酸磷酸化酶。此外，對嘧啶核苷途徑進行了基因工程改造，解除合成途徑的反饋抑制。通過生物發酵方法將重組菌株在5升發酵罐可達到20g/L以上的尿苷產量，可以實現工業化的量產，同時尿苷的生產成本低和減少污染少，綠色環保，具有較高的推廣應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種生產尿苷的重組微生物，利用重組微生物生產尿苷以及利用該重組微生物通過生物方法生產尿苷。

背景技術

尿苷，又名尿嘧啶核苷，屬于核苷的一種為白色針狀結晶或粉末，無氣味，味稍甜而微辛。能溶于水，微溶于稀醇，不溶于無水醇。

分子式C₉H₁₂N₂O₆,相對分子質量224.2，熔點163-167℃，比旋8.4°。它主要用于用于巨型紅血球貧血，也可與其他核苷、堿基合用于治療肝、腦血管及心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S-FC)、脫氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等藥物的主要原料。

目前尿苷的發酵生產主要集中在日本，但其供應的產品數量較少，且售價偏高。國內僅上海太平洋生物高科技公司一家曾采用RNA水解法生產尿苷，由于工藝落后，成本高，現已停產。尿苷生產主要有化學法和生物法兩種。

傳統的嘧啶核苷的生產方法是使用核糖核酸(RNA)經化學方法水解，然后制備兩種嘧啶核苷，這不僅需要大量的優質RNA原料，而且兩種嘌呤核苷(腺苷和鳥苷)及兩種嘧啶核苷(胞苷和尿苷)都必須平衡產銷，否則成本價會很高。浙江先鋒化工科技有限公司利用尿嘧啶和D-核糖在磷鎢酸催化下進行縮合反應獲得(CN101717420A)。反應成本高，且使用的有機溶劑存在環境污染。

而發酵法則是借助于微生物，通過誘變擴大其合成核苷的能力，從而能夠大規模地單一地根據市場需求生產尿苷，降低此類藥物的生產成本。20世紀80年代至90年代中期，日本科學家開始發表發酵法生產尿苷的成果，武田藥品株式會社利用誘變篩選獲得的桿菌發酵生產尿苷，但產量較低5g/L，且存在發酵不穩定等問題(CN85107905)。國內的研究尚未見放大生產的報道。

因此，需要開發一種能替代化學合成、降低污染的尿苷合成方法。人類已經利用微生物來發酵生產核苷類的產品，如beta-胸苷、鳥苷、肌苷和腺苷。而尿苷和上述核苷一樣，作為補救合成途徑中的一種嘧啶核苷酸中間體，在生物中普遍存在著尿苷的代謝途徑，但它很少積累在細胞中或細胞生物的基質中。改造生物，特別是微生物，使其增強尿苷的合成并積累在其生長的基質中，就可以有效地實現尿苷大規模工業化生產，從而降低尿苷的生產成本和減少污染。

預計國內市場年需求量約30噸，國際市場150噸，而世界目前年產量還不足50噸，所以發酵法生產尿苷市場前景看好，出口創匯可觀。

發明內容

發明目的：設計和生產具有高產量尿苷生產合成和積累能力的重組微生物，并利用該重組微生物實現尿苷的高產量生物法生產。

技術方案：

1.去除利用和降解尿苷的酶的編碼基因使尿苷不再參與細胞中的代謝