[發明專利]生產β-煙酰胺單核苷酸的重組微生物及其生產NMN的方法

有效

• 申請號: 202010498755.4
• 申請日: 2020-06-04
• 公開（公告）號: CN113755413B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發明（設計）人: 萬麗花;江君君;田鋒;陸紅霞;胡志浩
• 申請（專利權）人: 蘇州華賽生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/30;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州啟華專利代理事務所(普通合伙) 32357
• 代理人: 徐偉華

本發明提供了一種生產β?煙酰胺單核苷酸（NMN）的重組微生物，以及利用該重組微生物生產NMN的方法，所述重組微生物菌種含有一個或幾個下列特征或全部特征，這些特征是：（1）在發酵培養基中添加煙酰胺經由重組微生物轉化生成NMN；（2）過表達了煙酰胺磷酸核糖轉移酶。（3）重組微生物基因組上編碼堿性磷酸酶、核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種或多種生產β-煙酰胺單核苷酸的重組微生物構建，以及利用重組微生物生產β-煙酰胺單核苷酸。

背景技術

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide?mononucleotide，NMN?CAS:1094-61-7)是一種自然存在的生物活性核苷酸，有α和β2種不規則存在形式；而β-異構體是NMN的活性形式，分子式C11H15N2O8P，分子量334.22。它含有一分子煙酰胺組分，因為煙酰胺屬于維生素B3，因此NMN也被歸納到維生素B族衍生物，它是在煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt，EC?2.4.2.12)催化下，由煙酰胺(Nam)與磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反應的產物，同時是哺乳動物體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)補救合成途徑的關鍵前體。哺乳動物體內的NAD+經由細胞內的各種酶生成NMN和Nam，在NAD+供應不足時，細胞會重新利用NMN和Nam來合成NAD+。Nam在Nampt的催化下生成NMN，隨后NMN在煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶(Nmnat)的催化下生成NAD+，即NMN在人體內通過轉化為NAD+來發揮其生理功能，如激活NAD+底物依賴性酶Sirt1(組蛋白脫乙酰酶，又稱沉默調節蛋白)、調節細胞存活和死亡、維持氧化還原狀態等。

近期的研究發現，通過調節生物體內NMN的水平，對心腦血管疾病、神經退行性病及老化退行性疾病等有較好的治療和修復作用；另外，NMN還可通過參與和調節機體的內分泌，起到保護和修復胰島功能，增加胰島素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代謝性疾病的作用，因此，NMN在醫藥治療以及功能食品方面有著廣泛的應用前景。

NMN的體外制備方法分為化學合成，半酶法合成和全酶法合成，其中以化學合成為主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保護的核糖與煙酰胺在TMSOTf的催化下發生縮合反應；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化試劑對煙酰胺進行硅烷化，然后與乙酰核糖在TMSOTf的催化下進行反應；這些化學合成方法存在成本高、收率低而且化學試劑污染大等問題；半酶法合成是利用化學合成制備煙酰胺核糖，再利用煙酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN；全酶法則是利用煙酰胺磷酸核糖轉移酶以煙酰胺，磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN，不僅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸，整個合成中需要大量昂貴的ATP，而且由于現有的煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt)的酶活性較低，使得酶法反應存在耗時長、成本高、收率低等問題，難以實現工廠化大規模生產，因此限制了NMN的大規模應用。

生物發酵法生產NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途徑來生產NMN，克服酶法生產中的限制因素，其優勢在于以糖質為原料生產核苷酸類物質，符合食用習慣，生產成本低、效益高，特別是目前基因工程育種技術及高產優化控制技術的采用，使發酵法生產成本大大降低。

發明內容

本發明的目的是利用基因工程手段構建具有高產NMN的生物合成和積累能力的重組微生物，從而在菌種發酵過程中生產大量NMN，達到綠色環保低成本的NMN生產。

技術方案

本發明的技術方案可以應用大腸桿菌(Escherichia?coli)，芽孢桿菌(Bacillus)，乳酸桿菌(Lactococcus)，棒桿菌(Corynebacteria)，釀酒酵母(Saccharomyces)，下面以大腸桿菌為例，對技術方案進行進一步說明。