[發明專利]一種miRNA運載體系驗證方法

在審

• 申請號: 202010486558.0
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN111607619A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 童坤;肖瀟;黃磊
• 申請（專利權）人: 江蘇申基生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87
• 代理公司: 南京中軟知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32466
• 代理人: 鄭燕飛

1.一種miRNA運載體系驗證方法，其特征在于,具體包括如下步驟：

步驟一：先利用熒光素酶報告基因法對炔鍵修飾的雙鏈miR-34a的生物活性測試反應，通過并在miR-34a被成功負載到碳點表面之后，然后進行在體外水平輸運系統在還原性環境中對miR-34a釋放表征測試反應；

步驟二：根據細胞外各種酶發揮作用差異情況，癌細胞內還原性物種的濃度高于細胞外還原性物種濃度，分別測試該輸運系統在10 mM以及2μM的GSH環境下miR-34a的釋放數據；

步驟三：在所述步驟二測試過負載miR-34a的碳點可以在體外進行釋放數據后，然后進行細胞實驗測試其向細胞內輸運miRNA效率數據；

步驟四：在所述步驟三中測算過細胞內運輸miRNA效率指標參數后，接下來測試該輸運系統對癌細胞中miR-34a的運輸以及可控性釋放數據，最后驗證運輸到細胞內的miR-34a正常發揮功能反應數據；上述均依次循序完成后，最終得到該基于碳點的還原響應型miRNA輸運系統驗證結果。

2.根據權利要求1所述的一種miRNA運載體系驗證方法，其特征在于：所述步驟一中對炔鍵修飾的雙鏈miR-34a的生物活性測試，具體包括利用miRNA可以通過與靶基因3’-UTR中的一個段位點進行不完全互補配對從而抑制該靶基因翻譯，將靶基因中的該段位點插入到基因的3’-UTR，使miRNA與該段位點結合后抑制熒光素酶的產生，miRNA活性越高或表達量越大則熒光素酶產生的量越少，通過加入過量的熒光素酶底物檢測生物發光信號便可檢測出細胞內熒光素酶的表達量，從而測試反應出細胞內miRNA的活性以及表達量數據。

3.根據權利要求5所述的一種miRNA運載體系驗證方法，其特征在于,所述步驟三中輸運miRNA效率數據的測試，具體包括如下：

首先，通過MTT實驗驗證表征修飾連接子的碳點作為載體的生物相容性，驗證得到在濃度達到200 μg/mL，該載體仍然具有較低的細胞毒性；

隨后，將負載了miR-34a的碳點（miR-34a loaded carbon dots, MLCDs）與人宮頸癌細胞HeLa共孵育24 h后，通過QPCR檢測細胞內miR-34a的表達情況，驗證得到當HeLa細胞與負載了miR-34a的碳點共孵育時，細胞內miR-34a的表達才會明顯上調；

最后，通過激光共聚焦顯微鏡檢測負載了Cy3標記miR-34a的碳點與HeLa細胞共孵育24h后，Cy3標記的miR-34a以及碳點在細胞內的分布數據，發現24 h后，在細胞內可以檢測到miR-34a的信號以及碳點的熒光信號，且兩者不能完全重合，最終驗證了該體系可實現向細胞內運輸miR-34a，同時該體系在細胞內也可被還原從而釋放出miR-34a。

4.根據權利要求5所述的一種miRNA運載體系驗證方法，其特征在于,所述步驟四中驗證運輸到細胞內的miR-34a正常發揮功能數據，具體包括如下：

首先，利用Luciferase Assay驗證運輸到細胞內的miR-34a可以正常發揮功能；同樣的，將miR-34a的靶基因SIRT1的3’UTR可以與miR-34a結合的一段序列克隆至Luciferase報告質粒的Luciferase的3’UTR端，構建得到pMIR-miR-34a Luciferase報告質粒，將該報告質粒轉染到HeLa細胞中，4 h后加入負載有miR-34a的碳點共孵育48 h后檢測細胞內luciferase信號變化數據；當加入負載有miR-34a的碳點共孵育48 h后細胞內luciferase信號降低，驗證利用該輸運系統運輸進細胞的miRNA可以正常發揮功能；

隨后，進行再次驗證，將檢測加入負載有miR-34a的碳點共孵育48 h后細胞內SIRT1蛋白的表達水平數據，當加入負載有miR-34a的碳點共孵育48 h后細胞內SIRT1蛋白的表達量下調，再次驗證利用該輸運系統運輸進細胞的miRNA可以正常發揮功能。