[發明專利]可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體

在審

• 申請號: 202010484564.2
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN112094350A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 孟遜
• 申請（專利權）人: 普眾發現醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C07K16/30
• 分類號: C07K16/30;C07K16/28;A61P35/00
• 代理公司: 上海思牛達專利代理事務所(特殊普通合伙) 31355
• 代理人: 丁劍

1.一種可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：其工藝包括如下步驟：

S1，蛋白QC：采購商業化蛋白；

S2，動物免疫：選取6只Balb/c小鼠進行抗原免疫，并監測其血清效價以決定最優的免疫小鼠，初次免疫后會經過3到4次的加強，加強后將取小鼠血清檢測滴度，篩選出滴度合格的小鼠沖擊一次并用于融合，不合格的小鼠將繼續一到兩次加強至滴度最高后融合；

S3，血清檢測和篩選：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA檢測血清滴度，確定其血清效價合格；

S4，融合及篩選：取全脾和1/2的淋巴結，與骨髓瘤SP2/0細胞系融合，融合細胞鋪到4塊384孔板上，進行培養，收集所有孔的上清，用ELISA對免疫蛋白進行篩選，鏡檢有細胞的陽性孔轉到96孔板繼續培養，生長幾天后，收集所有孔的上清，用ELISA檢測與可溶片段檢測原的反應，陽性孔進一步檢測不同稀釋度的蛋白結合，以進行親和力排序，每個融合選免疫原親和力最高的20個親代克隆進入亞克隆；

S5，亞克隆及篩選：通過有限稀釋法和ELISA篩選進行亞克隆，得到單克隆雜交瘤細胞，細胞鋪96孔板，并培養至覆蓋約1/6的底部，ELISA檢測每個孔上清針對免疫抗原的反應，取OD值高且細胞狀態良好的兩個孔進入下輪亞克隆，重復上述步驟直到孔中細胞株陽性率100％，此時得到單克隆細胞株，經過最后一輪亞克隆后，所有陽性細胞立即擴大培養，一部分凍存供以后使用，另一部分進行上清或腹水制備；

S6，抗體上清制備：將最后獲得的單克隆細胞株，通過腹部注射到F1小鼠用于抗體生產，產生的腹水用Protein A/G純化，并用于后續檢測；

S7，抗體驗證：對獲得的單克隆抗體細胞株進行ELISA，Western blotting，免疫共沉淀加質譜，抗體芯片等驗證，確定最有效抗體。

2.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S2中Balb/c小鼠為8-12周齡的Balb/c小鼠。

3.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S3中血清效價合格線為血清效價大于10K。

4.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S4中的融合工藝為優化過的PEG融合。

5.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S4中4塊384孔板上每孔細胞為10²～10⁴。

6.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S7中的ELISA驗證具體為：取待檢測的抗體包被96孔ELISA板，孵育，洗滌后脫脂牛奶過夜封閉，進行PBS洗滌后4℃保存待用；再進行抗原孵育，PB S洗滌，同時設置對照，加入His-HRP,TMB顯色反應，酶標儀讀數。

7.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述S7中的抗體芯片具體為：使用芯片點樣儀將抗-CD326抗體及對照抗體點制于以NC膜為基質的玻璃片，形成直徑為100um的抗體點，將A375的全蛋白進行生物素標記，按2ug/ml的濃度孵育在抗體芯片上，室溫孵育半小時，PBS輕柔清洗三遍，再用CY3-SA熒光二抗進行孵育，PBS清洗三遍，使用GenePix熒光芯片掃描儀523nm掃描芯片。

8.根據權利要求1所述的可應用于腫瘤細胞捕獲的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體，其特征在于：所述的小鼠抗細胞表面糖蛋白CD326的單克隆抗體可變區測序結果為：

VHF1

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS

VHCDR1

GYTFINYG

VHF2

MNWVQQAPGKGLKWMGW

VHCDR2

INTYTGEA

VHF3

TYGDDFKGRFDLSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFC

VHCDR3

VRFVNPMDY

VHF4

WGQGTSVTVSS

VLF1

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS

VLCDR1

KSVSTSGYSY

VLF2

MHWNQQKPGQPPRLLIY

VLCDR2

LVS

VLF3

NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCVLCDR3

QHIRELT

VLF4

FGGGTKLEIK。