[發明專利]一種新型冠狀病毒COVID-19感染檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010478049.3
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111471803A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 張翼;孫月;張倩;陳棟;程超;劉圓圓;王啟
• 申請（專利權）人: 武漢生命之美科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/6848;C12R1/93
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種新型冠狀病毒COVID?19感染檢測試劑盒，屬于體外診斷試劑領域。本發明試劑盒包括檢測新型冠狀病毒COVID?19特異基因ORF1ab的引物與探針，檢測陽性內標基因GAPDH的引物與探針，檢測外源監控基因EGFP的引物與探針，序列分別如SEQ ID NO.1?9所示；該試劑盒在保證檢測結果準確性和穩定性和前提下，提高檢測通量。本發明使用Trizol試劑作為樣品保存液，保證了生物安全性、核酸完整性、病毒載量。本發明在提取RNA時引入外源監控基因的RNA，可以監控整個提取檢測過程的RNA損失情況，保證整個操作過程的規范性，排除由于操作過程任何步驟的缺陷造成的假陰性。

技術領域

本發明屬于體外診斷試劑領域，具體涉及一種新型冠狀病毒COVID-19感染檢測試劑盒。

背景技術

新冠病毒肺炎疫情發生以來，核酸檢測一直是臨床診斷、康復出院、解除隔離的“金標準”。目前普遍使用的熒光定量PCR方法步驟包括：樣品采集，核酸提取，熒光定量PCR檢測，通過檢測送檢樣本中是否含有新冠病毒的特異性基因，進而判斷樣本中是否含有新型冠狀病毒。

但是目前核酸檢測普遍存在假陰性和假陽性的問題，也就是準確性和靈敏性的問題。這主要是由于新冠病毒是一種RNA病毒，而RNA酶具有一定的穩定性，且來源廣泛，人體及環境中無處不在的RNA酶，可能會在樣品采集、運輸、保存、提取和檢測的各個環節，造成RNA的降解；除此之外還有采樣體積大，對病毒載量造成稀釋；檢測結果無法量化不同病人的病毒載量；整個過程缺乏監控等。對于檢測結果，一方面無法判斷是否是采樣失敗或樣品稀釋造成的病毒載量不足，另一方面無法確認實驗操作中的核酸損失情況，也無法對不同病人攜帶的病毒載量進行準確描述。嚴重阻礙疑似病例的確診和對潛在帶毒者的篩查，以及對于患者病程的監控。

關于樣品采集，目前常用的方法主要有兩種：非滅活的病毒保存液和滅活的病毒保存液，采樣體積一般是3-4mL，現有方法通常會取其中的0.2-1mL樣本進行核酸提取，稀釋了樣品，降低了潛在的病毒載量，進而使得檢測靈敏度大大降低。如果采用非滅活的病毒保存液，可以通過增加離心收集細胞沉淀的步驟，獲得全部樣品進行后續裂解和提取，但同時增加了運輸過程的生物危害性。

關于樣品提取，現有方法常用的是直接進行柱提法和磁珠法提取，但是提取過程中可能會由于操作流程或者人為因素帶來樣本損失，從而造成樣本提取失敗，如何界定采樣失敗或者樣品提取失敗所造成的假陰性，并且不同樣本之間提取效率差異如何界定，有待解決。

關于RT-QPCR檢測，對于檢測結果的判定，僅僅對于病毒特異基因的陰性檢測結果，無法判定是否是由于采樣運輸失敗或者是核酸提取失敗而造成的假陰性，需要設置陽性內標基因。同時，相對于RT和QPCR分步法和染料法檢測，一步探針法檢測是更準確和高效的檢測方法，但是由于該方法沒有消解基因組污染的步驟，陽性內標基因帶來的基因組檢測干擾，也會誤導對樣品合格性的判定。增加內標基因的檢測，提高了對結果準確性的解讀，但是也限制了檢測通量，增加了檢測成本。

關于氣溶膠污染造成的假陽性的問題，普遍使用的方法是嚴格進行實驗室分區管理，設置陰性對照。除此之外，反應中使用UDG酶，也是非常有效的防止氣溶膠污染的手段。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術存在的缺點與不足，提供一種新型冠狀病毒COVID-19感染檢測試劑盒；此外，還提供新型冠狀病毒COVID-19樣品的保存方法以及RNA提取方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種新型冠狀病毒COVID-19感染檢測試劑盒，包含：檢測新型冠狀病毒COVID-19特異基因的引物與探針，檢測陽性內標基因的引物與探針，檢測外源監控基因的引物與探針。其中，新型冠狀病毒COVID-19特異基因與陽性內標基因進行雙重PCR。

進一步地，所述的新型冠狀病毒COVID-19特異基因為ORF1ab，陽性內標基因為GAPDH，外源監控基因為EGFP。