[發(fā)明專利]人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的組合物與方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010477310.8
• 申請(qǐng)日: 2020-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN111635889B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵志成;方詩;許錦洪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/079;C12N5/0793
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.利用組合物將人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的方法：其特征在于，所述組合物包括能夠?qū)崿F(xiàn)OCT4過表達(dá)的物質(zhì)，敲低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p53的物質(zhì)，以及促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物，所述促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物為CHIR99021、SB431542、RepSox?與Y27632的組合，CHIR99021的用量為1.5μM，?SB431542的用量為5μM，?RepSox的用量為1μM，Y27632的用量為10μM；

利用該組合物協(xié)同作用將人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元并誘導(dǎo)產(chǎn)生3D皮層類器官和脊髓類器官。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，包括如下步驟：

用AM培養(yǎng)基培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞至80-90%的密度；

人星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入能夠?qū)崿F(xiàn)OCT4過表達(dá)的物質(zhì)，以及敲低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p53的物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)OCT4過表達(dá)和p53敲低；

用AM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，到第三天開始加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物進(jìn)行誘導(dǎo)；

從加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物開始，培養(yǎng)基換為神經(jīng)元培養(yǎng)基，2或3天更換培養(yǎng)基，第8天，不再向神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物，保持2-3天更換新鮮的神經(jīng)元培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至21天。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，包括如下步驟：

用AM培養(yǎng)基培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞至80-90%的密度；

人星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入能夠?qū)崿F(xiàn)OCT4過表達(dá)的物質(zhì)，以及敲低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p53的物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)OCT4過表達(dá)和p53敲低；

用AM培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，到第三天開始加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物進(jìn)行誘導(dǎo)；

從加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物開始，培養(yǎng)基換為神經(jīng)元培養(yǎng)基，2或3天更換培養(yǎng)基，第8天，不再向神經(jīng)元培養(yǎng)基中加入促進(jìn)誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元或類腦器官的小分子藥物，保持2-3天更換新鮮的神經(jīng)元培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

第14天誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量玫瑰叢樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集成球形結(jié)構(gòu)；

至第21天，用基質(zhì)凝膠Matrigel包埋，球狀體有神經(jīng)上皮樣出芽生長(zhǎng)，至85-95天，能夠生長(zhǎng)到大小為3-4mm，形成類似于由人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的大腦皮層類器官。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，通過調(diào)控脊髓發(fā)育誘導(dǎo)信號(hào)分子，重編程的星形膠質(zhì)細(xì)胞被成功地誘導(dǎo)為脊髓類器官，對(duì)于脊髓類器官定向制備，第16-18天，加入bFGF?20ng/ml?和視黃酸?100nM?處理3天，細(xì)胞在神經(jīng)元培養(yǎng)基中誘導(dǎo)聚集成球狀，第19天開始，在神經(jīng)培養(yǎng)基中加入SHH信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG?500nM，SAG的誘導(dǎo)持續(xù)10天后，加BMP415ng/ml持續(xù)3天。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，在完成BMP4誘導(dǎo)時(shí)，用基質(zhì)凝膠Matrigel包埋，然后轉(zhuǎn)移到超低吸附的培養(yǎng)皿中放在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。