[發(fā)明專利]一種表達(dá)熒光素酶的高產(chǎn)酒克雷伯菌及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010475653.0
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111607550A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 滑明溪;陳晨;曾輝;李昂;袁靜
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/04;A61L2/10;A61L2/18;A23L3/28;A23L3/349;A23L3/358;C12R1/22;A61L101/20;A61L101/02;A61L101/34
• 代理公司: 北京國標(biāo)律師事務(wù)所 11753
• 代理人: 姚克楓;董琪

本發(fā)明利用質(zhì)粒構(gòu)建和電轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建了含有熒光素酶基因簇(luciferase gene cassette,lux)的高產(chǎn)酒克雷伯菌，經(jīng)自發(fā)熒光鑒定及菌株的傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)與培養(yǎng)特性的觀察,最終獲得了可穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的高產(chǎn)酒克雷伯菌(HiAlc Kpn?LUX)。為研究產(chǎn)酒克雷伯菌相關(guān)疾病進(jìn)展，篩選合適的殺菌方法、抗生素等提供重要的可視化研究工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有熒光素酶基因的泛宿主質(zhì)粒和穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的基因改造的高產(chǎn)酒克雷伯菌的構(gòu)建方法，該方法構(gòu)建獲得的菌株，以及該菌株在計(jì)算細(xì)菌濃度的評估方法、篩選殺菌方法、篩選藥物以及制備感染動(dòng)物模型等方面的用途。

背景技術(shù)

研究表明，我國約60％的非酒精性脂肪肝的發(fā)病與患者腸道中高產(chǎn)酒性肺炎克雷伯菌(high-alcohol-producing Klebsiella pneumoniae，HiAlc Kpn)相關(guān)。從非酒精性脂肪肝患者腸道分離的HiAlc Kpn移植至小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，HiAlc Kpn能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生非酒精性脂肪肝。對上述腸道內(nèi)定植HiAlc Kpn的小鼠飼喂葡萄糖能夠在小鼠的血液中檢測到酒精。因此HiAlc Kpn可以作為非酒精性脂肪肝的一個(gè)新的檢測指標(biāo)。

目前對HiAlc Kpn誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制等研究剛剛起步，因此亟需有力工具研究HiAlc Kpn感染途徑、HiAlc Kpn在體內(nèi)定位和擴(kuò)散的特點(diǎn)、評估現(xiàn)行抗生素使用的療效、適合的藥物，例如抗生素或其他殺菌方法的效果。

生物發(fā)光是生物體內(nèi)在酶的作用下發(fā)光的現(xiàn)象。生物發(fā)光現(xiàn)象廣泛存在細(xì)菌、昆蟲等生物體中。利用螢光素酶基因(luciferas gene cassette，LUX)基因標(biāo)記細(xì)胞的生物發(fā)光技術(shù)具有操作簡便、結(jié)果直觀、不依賴底物、對機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤生長監(jiān)測和轉(zhuǎn)移示蹤、基因治療、目標(biāo)基因表達(dá)的檢測等多個(gè)領(lǐng)域。

我們構(gòu)建了含有螢光素酶基因LUX A/B/C/D/E的泛宿主質(zhì)粒pBBR1-LUX。該質(zhì)粒能夠在碳青霉烯耐藥克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌中穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶。該質(zhì)粒能夠在HiAlcKpn穩(wěn)定存在，并產(chǎn)生氯霉素耐藥，但是不能表達(dá)熒光素酶。因此，需要一種改進(jìn)的方法，使得高產(chǎn)酒性肺炎克雷伯菌能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述缺陷，我們改進(jìn)了pBBR1-LUX，構(gòu)建時(shí)在LUX A/B/C/D/E之前添加了組成型啟動(dòng)子。本發(fā)明構(gòu)建包含組成型啟動(dòng)子和螢光素酶基因LUX A/B/C/D/E基因簇的質(zhì)粒，并將通過電轉(zhuǎn)化至高產(chǎn)酒克雷伯菌，經(jīng)過傳代，篩選可穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的基因改造的高產(chǎn)酒克雷伯菌，并將其用于計(jì)算細(xì)菌濃度的評估方法、篩選合適的殺菌方法、篩選藥物以及制備感染動(dòng)物模型等方面。因此，

本發(fā)明提供一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含組成型啟動(dòng)子和螢光素酶基因LUX A/B/C/D/E基因簇。

優(yōu)選的，本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)含有組成型啟動(dòng)子和LUX A/B/C/D/E的質(zhì)粒。所述質(zhì)粒為泛宿主質(zhì)粒，該質(zhì)粒可以在大腸桿菌中完成構(gòu)建過程，其啟動(dòng)子能夠被高產(chǎn)酒肺炎克雷伯菌識別。

本發(fā)明還提供一種基因改造的高產(chǎn)酒肺炎克雷伯菌，所述基因改造的高產(chǎn)酒克雷伯菌能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶。優(yōu)選的，所述基因改造的高產(chǎn)酒肺炎克雷伯菌能在組成型啟動(dòng)子的作用下穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶。

本發(fā)明還提供一種上述基因改造的高產(chǎn)酒克雷伯菌的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

(1)制備包含LUX A/B/C/D/E基因簇的質(zhì)粒；優(yōu)選的，所述質(zhì)粒為泛宿主質(zhì)粒，更優(yōu)選的，該質(zhì)粒包含一個(gè)組成型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠被高產(chǎn)酒肺炎克雷伯菌識別，使得高產(chǎn)酒克雷伯菌能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，從而能檢測到熒光。

(2)制備高產(chǎn)酒克雷伯菌的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)；