[發(fā)明專利]一種華北落葉松胚性組織超低溫保存的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010475541.5
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111466294B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設計）人: 趙健;陳曉藝;江帥菲;張金鳳;孔立生;崔瑩;李珊珊
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學;神舟綠鵬農業(yè)科技有限公司
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 喻蓉

本發(fā)明公開了一種華北落葉松胚性組織超低溫保存的方法，包括對華北落葉松胚性組織(華北落葉松的細胞系胚性愈傷組織)進行滲透劑濃度逐漸升高的液體梯度預培養(yǎng)處理。梯度預培養(yǎng)處理后的華北落葉松胚性組織進行超低溫冷凍保存，使用時再進行解凍處理。本發(fā)明方法適于對華北落葉松的優(yōu)良胚性細胞系的長期超低溫保存，采用本發(fā)明方法長期保存華北落葉松胚性細胞后，細胞存活率高，胚性組織恢復培養(yǎng)迅速，而且胚性愈傷組織恢復生長率高，達到66％以上。

技術領域

本發(fā)明涉及一種植物愈傷組織的保持方法，特別涉及一種華北落葉松細胞系胚性愈傷組織的低溫保存方法，屬于林木育種的組培技術領域。

背景技術

常溫條件下，胚性培養(yǎng)物的長期繼代保存，往往存在著許多不可避免的問題：首先，長期重復的繼代保存，繼代成本高；并且，如果在操作過程中出現(xiàn)人為或環(huán)境干擾，造成培養(yǎng)物的污染，很可能造成胚性細胞系的重大損失；更加值得注意的是，經過長時間的繼代培養(yǎng)，可能會引起體細胞無性系變異，從而導致胚性培養(yǎng)物胚性能力的下降甚至喪失。超低溫冷凍保存技術是目前應用十分廣泛和成功的種質長期保存的方法，它能夠有效地遏制變異的發(fā)生，保存胚性材料的發(fā)育潛能，且以最少的量和最低的風險保存材料的完整性。國外采用體細胞胚胎發(fā)生快速繁殖已成為針葉樹優(yōu)質苗木規(guī)模化生產的重要途徑，而且體細胞胚胎發(fā)生技術可以和冷藏保存法結合起來。將植物組織長期儲存于液氮中，便于進行長期無性系試驗。

現(xiàn)有植物胚性愈傷組織保存方法主要有如下兩種，培養(yǎng)繼代保存法和超低溫冷凍保存法，其中超低溫保存方法需要在低溫保存前對組織進行預培養(yǎng)，使愈傷組織適當脫水，降低細胞內含水量，使細胞的分裂與分化同步，從而增強材料在面對低溫保存過程中劇烈的溫度變化和高度脫水時的抗逆境能力。針葉樹胚性組織的超低溫保存預培養(yǎng)的常見方法是預培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加高濃度蔗糖、山梨醇等，提高滲透壓，使細胞脫水，以達到增加抗寒能力的作用。

雖然現(xiàn)有的低溫冷凍保存方法能夠在一定程度上降低遺傳變異頻率，保證遺傳穩(wěn)定性以及細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能保存，但是不同超低溫冷凍保存方法中預培養(yǎng)時間、預培養(yǎng)基成分及預處理等不同，胚性組織恢復，解凍后的細胞存活率以及恢復生長率也不同。例如：申請?zhí)枮镃N201910437126.8的發(fā)明專利申請公開了一種抗松材線蟲病馬尾松胚性愈傷組織超低溫保存方法，將馬尾松細胞系的胚性愈傷組織置于含有蔗糖的增殖培養(yǎng)基中預處理后，于冷凍管中，加入冷凍保護劑，進行程序降溫，溫度降至-80℃后取出冷凍管并迅速投入液氮，進行超低溫保存；使用時，取超低溫保存胚性愈傷組織水浴溫度為30℃～40℃條件下進行解凍，待冰完全溶化后立即將冷凍管取出，雖然在30-35℃解凍后的胚性愈傷組織細胞活性最高達100％，超低溫保存后的愈傷與正常增殖的愈傷組織在外觀及顯微結構上無明顯差異，且低溫保存后的愈傷組織仍具有分化形成體胚的能力，但上述專利在冷凍保存前，才將固體培養(yǎng)物放在液體中分散，再進行預培養(yǎng)。本專利采用的是長期繼代保存的液體增殖培養(yǎng)物，本身組織分散性、均一性更好，且組織長期在液體培養(yǎng)基中生長，適應性更強。

本發(fā)明就華北落葉松胚性細胞系超低溫冷凍保存進行探究，探討適合于華北落葉松胚性培養(yǎng)物超低溫冷凍保存中材料預培養(yǎng)、冷凍保存方式等流程的方法，以期為長期穩(wěn)定低保存華北落葉松胚性培養(yǎng)物等種質資源奠定技術基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有植物愈傷組織超低溫保存過程中存在預處理方法、冷凍保護劑及超低溫保存后的解凍方法等方面的缺陷，提供一種華北落葉松胚性組織超低溫保存的方法，通過調整預處理培養(yǎng)基培養(yǎng)以提高預培養(yǎng)效率和恢復生長效率。本發(fā)明方法通過液體梯度預處理與采用混合型冷凍保護劑更適合于華北落葉松胚性愈傷組織的冷凍保存，且在37℃水浴解凍后的胚性愈傷組織細胞活性最高達78％，超低溫保存后的愈傷與正常增殖的愈傷組織在外觀及顯微結構上無明顯差異，且低溫保存后的愈傷組織仍具有分化形成體胚的能力。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種華北落葉松胚性組織超低溫保存的方法，包括對華北落葉松胚性愈傷組織進行滲透劑濃度逐漸升高的液體梯度預培養(yǎng)處理。